1910年,Davis首次把胎膜(羊膜+絨毛膜)用于移植取得成功,爾后羊膜移植被廣泛用于各種手術,作為燒傷皮膚移植片、人造陰道粘膜鞘、皮膚外傷覆蓋物及頭部、腹部、骨盆和耳鼻喉手術中防止組織粘連的底物[2]。1940年,DeRotth首次報道了應用羊膜覆蓋治療眼表上皮缺損,但上述研究未引起重視和推廣。直到1995年,Kim和Tseng在兔化學燒傷模型的角膜表面進行羊膜移植,產生角膜上皮化和角膜型角蛋白的表達,羊膜移植逐漸引起眼科醫師的重視。羊膜的組織生理特性決定了它適合于眼表疾病的治療。羊膜組織可以在-80℃的環境中保存數月。羊膜不表達HLA-A,B或DR抗原,移植后幾乎不引起免疫排斥。另
外,羊膜組織被認為有抗微生物的特性,降低了術后感染的發生率。抗纖維形成[8]和促進細胞移行、分化也是羊膜的一個顯著功能。本文主要對羊膜的組織生理特性、移植作用機理以及目前在眼科的應用范圍作一綜述。
1 羊膜的組織和生理學特點
人羊膜是從細胞滋養層衍化而來,是人類兩層胎膜的內層。正常羊膜薄而透明,無血管,厚度為.02~0.05mm。光鏡下羊膜分5層:(1)上皮層:大部分羊膜上皮為單層立方形,而胎盤胎兒面羊膜上皮為柱狀;(2)基底膜:由狹窄的無細胞網狀纖維構成,厚度不一;(3)致密層:薄而致密,羊膜的張力決定于此層的結構。此層與基底膜連接緊密,而與下面的纖維母細胞層相接較松。致密層由網織纖維組成,HE染色呈淡伊紅色均質帶,一般無細胞,對母體的細胞浸潤有一定的阻力;(4)纖維母細胞層:是羊膜厚度的主要組成部分,
由疏松纖維母細胞和網狀纖維組成;(5)海棉層:來源于胚外體腔上皮網狀纖維,由波浪狀網織纖維束構成,象彈力纖維一樣具有伸展性。臨床上一般將羊膜分為二層:上皮層和基底層。
羊膜上皮細胞的表面有許多微絨毛,基底部有細胞突起伸入基底膜形成足突樣結構。電鏡下,細胞突起與基底膜之間通過張力細絲(半橋粒結構)形成緊密連接。基底膜主要由部分無定形物質和部分微纖維構成。細胞質內富含胞飲小泡,胞質豐富,含有大量內質網池和高爾基體,核仁外形不規則,核膜富有凹痕,提示核分裂活躍。上皮細胞的超微結構與羊膜的特殊功能密切相關,正是由于這種結構的存在決定了
羊膜可以行使其3個主要功能:作為覆蓋上皮、作為分泌活躍的上皮和有強大的細胞間和經細胞轉運功能。
2 羊膜移植的作用機理
2.1 促進上皮化 眼表上皮細胞正常增生和分化有賴于正常上皮下基質的存在,基底膜促使上皮細胞移行,增強上皮細胞的粘附性,推動上皮細胞的分化,同時防止上皮細胞凋亡。羊膜是一層薄的、半透明的組織,形成胎膜的內層,含有人體中最厚的基底膜,由發育安全的Ⅳ、Ⅴ型膠原和板層構成,這些都是構成人體基底膜的主要成分。把羊膜和角膜、結膜基質中含有的Ⅳ型膠原類型和板層結構進行比較,發現除結膜上皮基底層和羊膜基底膜含有的Ⅳ型膠原α2與角膜上皮基底層含有的是Ⅳ型膠原α5不同外,其余成分基本相同,提示羊膜基底膜和眼表上皮基底層組織成分相近。羊膜移植機制不同于其他粘膜移植,在唇粘膜、鼻粘膜移植中移植的是活的上皮細胞,羊膜移植移植的是基底層,通過羊膜移植,為病變組織提供了健康的上皮下基質環境,促使正常上皮化的發生。另外,羊膜細胞產生許多生長因子,如成纖維細胞生長因子、細胞生長因子等,這些均可促使上皮化的發生,但值得一提的是經冷凍保存的羊膜細胞生長因子分泌顯著減少,一定程度上削弱了羊膜的促上皮化的功能。有研究證實羊膜還有抑制前列腺素活性的作用。深入實驗證明人羊膜能在雞受精卵絨毛膜尿囊上誘導產生上皮細胞,這項成果為羊膜移植用于臨床奠定了基礎。
2.2 抑制纖維形成 瘢痕形成和纖維化是各種不同病理損傷所產生的傷口愈合后的共同結果,它包括由細胞-細胞間、細胞-基質間通過各種細胞因子相互作用來調節的復雜生理過程。其中,控制纖維發生的原始型細胞因子是轉移生長因子-β(TGF-β)。它的異常表達與纖維形成和炎癥過程有關,TGF-β最主要的作用是刺激不同的細胞外基質蛋白合成和積聚,促進蛋白酶抑制物的生成,調高細胞粘附分子的濃度,抑制基質降解蛋白酶的合成,總的來說,這些作用使細胞和基質相互作用增強,導致傷口愈合中的纖維形成。TGF-β
有3種不同的同分異構體,它們是:TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,分別由不同的基因編碼,被哺乳動物細胞系統所表達。這些TGF-β在成熟的多肽片段中有很高的結構等同性,在培養基中也有相同的生物作用。已證實TGF-β1、TGF-β2被人類眼前段所表達,它們通過與受體結合而起作用,TGF-β的Ⅱ型受體(TGF-βRⅡ)與TGF-β的作用有關。在傷口愈合過程中,基質成纖維細胞通常轉化為肌成纖維細胞,這個過程叫作成纖維細胞活化。成纖維細胞活化過程也可在由撕裂或穿通傷所致的角膜傷口愈合中發現。這個生化過程與肌成纖維細胞的形態學改變等同,包括公認的細胞內收縮裝置的表達。這些收縮裝置有細胞內F-肌動蛋白微絲束,由α-SM、α-輔肌動蛋白、肌球蛋白、α5β1-整合素的膜受體(如高親合力的纖維結合素受體)組成。在所有的細胞因子中,TGF-β是最重要的α-SM調高因子,同時通過角膜成纖維細胞調高α5β1-整合素的表達,是成纖維細胞活化的標志。羊膜能降低TGF-β信號系統的表達,從而阻止成纖維細胞活化過程,最
終減少瘢痕形成。實驗證明,當培養人角膜和角膜緣成纖維細胞與羊膜基質接觸后迅速關閉它們對TGF-β和TGF-βRⅡ的表達,從而使相應的α-SM、α5β1-整合素產生減少,使纖維形成減少。成纖維細胞和羊膜基質接觸后關閉對TGF-β的表達類似以往的關于哺乳動物上皮細胞接種到基底膜上后關閉對TGF-β的表達的報道,推測上皮和間充質細胞能識別一定的基質環境。如果改變它們的天然基質環境,將會啟動TGF-β信號系統。羊膜基質成分與眼表上皮基底成分相近,因此對TGF-β的表達起抑制作用。
2.3 低抗原性 用熒光染色技術在新鮮收集或試管內培養的人羊膜上皮細胞內均未發現HLA-A,B,C和DR抗原以及β2-微球蛋白的表達。進一步用更敏感的放射生物技術來檢測,可發現少量HLA-A,B,C和DR抗原以及β2-微球蛋白的表達。Adinolfi等為了檢測羊膜上皮細胞所產生的少量抗原是否會引起排異反應,選取7個正常成人進行皮下羊膜移植,觀察6周,未檢測到肉芽組織形成、炎性細胞浸潤、新生血管形成等提示急性排異產生的現象。實驗和臨床觀察證明絨毛膜具有很強的抗原性,而羊膜的抗原性很低,作為自體移植可以完全被接受,用來異體移植則反應很小。
2.4 抗微生物性 許多學者觀察到羊膜移植術后感染發生率遠遠低于唇粘膜、鼻粘膜移植術,認為羊膜有抗微生物特性。羊水中含有豐富的溶酶體、轉移因子、7S免疫球蛋白和β1c、β1a球蛋白等具抗微生物特性的物質,但這些物質在羊膜中均不能檢測到。Talmi等認為羊膜強大的粘附能力和移植后與植床的緊密接觸(通過彈力蛋白-纖維連接)是羊膜具有抗微生物特性的主要原因,通過緊密接觸,宿主自身的防御機制得以發揮作用,從而降低術后感染的發生率。
3 移植羊膜片的制備
3.1 從剖腹產的健康人[排除含有人類免疫缺陷性病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)及梅毒]胎盤上采取,剪成2cm×2cm,用4.0×106U·mL-1慶大霉素液清洗,放入900g·L-1甘油瓶中,脫水24h后,轉移至另一甘油瓶中,密封放入4℃冰箱中保存。使用時用生理鹽水沖去甘油,泡入4.0×106U·mL-1慶大霉素BSS液中,復水30min后使用。
3.2 取剖腹產孕婦的胎盤,產前母體行血清學檢察,排除含有HIV、HBV、HCV及梅毒。剖腹產后立即取其胎盤,在層流罩下,用含50mg·L-1青霉素、50mg·L-1鏈霉素、100mg·L-1新霉素、2.5mg·L-1兩性霉素B的Earle平衡液清洗胎盤。取其羊膜,平鋪于帶有0.45μm微孔的硝酸纖維素濾紙上。將覆有羊膜的濾紙,切成3cm×4cm的團塊,在術前貯藏于-80℃、含有Dulbecco改良的Eagle基質和甘油(二者比例為1∶1)的無菌瓶內備用。術前將容器于低溫下解凍后使用。
4 羊膜移植在眼科的應用
4.1 羊膜移植可以替代結膜瓣覆蓋和瞼縫合術用來治療持續性眼表上皮缺損經藥物治療無效的病例,由于羊膜組織是透明的,移植后對視力影響很小,尤其適合患眼仍有良好視力的患者。角膜潰瘍累及基質層時,用多層羊膜覆蓋比較有效。值得一提的是新近穿孔或腫脹嚴重的角膜用羊膜移植來治療效果不佳。
4.2 翼狀胬肉切除術后可用羊膜移植來替代自體結膜移植修復缺損。據統計,羊膜移植后翼狀胬肉復發率(10.9%,限于原發性翼狀胬肉)低于鞏膜暴露療法(45%),但高于自體結膜移植(2.6%)。盡管自體結膜移植看來是最安全的方法,在某些病例如伴隨彌漫性結膜病變或球結膜必須被保留以備將來行青光眼濾過手術,羊膜移植不失為一種合理的選擇。
4.3 角膜干細胞缺乏常伴有角膜上皮結膜化,未經治療可以引起角膜血管化、瘢痕產生、鈣化、潰瘍形成、融合和穿孔。對于這類患者,行傳統的角膜移植效果很差,因為板層或穿透性角膜移植僅僅提供臨時的角膜覆蓋上皮,不能恢復干細胞功能。在彌漫性角膜干細胞缺損的病例中,干細胞移植(自體或異體)是角膜上皮重建的必要步驟,但單純行干細胞移植,由于術后免疫排異、瘢痕產生、干細胞生存的微環境缺乏等原因,成功率很低。羊膜移植提供健康的基底膜,與干細胞移植聯合應用,曾經成功地被用來治療彌漫性干細胞缺損和嚴重的眼表疾病,如Stevens-Johnson綜合征、進展性眼瘢痕性天皰瘡、化學和熱燒傷等。同樣地,自體干細胞和角膜上皮可以在含有羊膜的培養基中培養后用于角膜表面重建。
4.4 Fujishima等[27]最近把羊膜移植用于青光眼濾過手術中并聯合小劑量絲裂霉素C來抑制瘢痕形成和促進濾過。術中在鞏膜瓣下置羊膜移植片,術后14眼中13眼濾過良好,眼壓得到控制。長期以來,濾過手術后眼球外改變(結膜下瘢痕化)是手術失敗的主要原因,抗纖維藥物、絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶常被用來抑制瘢痕形成,但并發癥的發生率也隨之增高。羊膜具有抗纖維化的特性,從理論上來說是一種安全有效的移植物,在青光眼濾過手術中起到抑制瘢痕形成的作用。
4.5 濾過手術后濾過泡破裂可產生低眼壓、淺前房和脈絡膜脫離,嚴重的引起濾過泡感染甚至眼內炎的發生。發生這種情況需要及時處理,修補方法包括冷凍固定術、Nd:YAG激光、氰丙烯鹽酸膠、纖維組織膠和手術修補。Budenz等最近報道用人羊膜來修補破裂的濾過泡,在5例患者中均取得成功。

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