自体骨髓干细胞移植---治疗肝病的新曙光?

http://www.apsc.com.hk

由于受到肝源的限制和不菲肝移植费用。最近似乎兴起自体骨髓干细胞移植。不知大家对这个有什么看法？
下面是相关的新闻连接。

自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化在广州获成功
近日，一名慢性乙肝肝硬化患者在广东岭南肝病研究所进行自体骨髓干细胞移植获成功。目前，该患者肝功能各项指标恢复正常，从而达到骨髓干细胞变成肝细胞代行肝功能的治疗目的。开创了国内临床采用高科技手段治疗乙肝肝硬化的新途径。

据中山大学干细胞与组织工程研究中心许瑞云教授称，自体骨髓干细胞移植是世界上最前沿、最热门的医疗技术，它与传统肝移植治疗方法相比，不存在免疫排斥及伦理问题。

这项技术风险小、痛苦少、费用低，而它的原理也很简单。将患者健康的骨髓分离出干细胞，并将干细胞经肝动脉输入到病肝内，这些干细胞在肝内“落户”。因骨髓干细胞有着很强的“因地分化”特性，在什么样的环境条件导引下就可以分化为什么样的细胞。当骨髓干细胞被移植到患者肝脏组织后，就像种入肝脏的种子，在肝脏微环境调节下“入乡随俗”地分化为肝细胞，新生的肝细胞便承担起病肝不能胜任的工作，从而明显地改善了患者的肝功能，好象轻松地给患者移植了肝脏。

许瑞云说，目前终末期乙肝肝硬化尚缺乏特效的治疗手段，最好的选择是原位肝移植，但是肝脏移植存在供肝奇缺、费用昂贵及术后免疫移植排斥反应等诸多难题，这大大限制了肝移植的临床应用。

而自体骨髓干细胞移植治疗乙肝肝硬化，手术操作过程相对简单、术后不存在肝移植排斥反应等并发症，且费用相对低廉。

许瑞云说，近年来，随着分子生物学和细胞生物工程技术的发展，通过干细胞移植治疗肝硬化逐渐成为研究的热点。但由于干细胞无法杀死肿瘤细胞，因此，自体干细胞移值技术尚无法应用于肝癌的治疗。

自体骨髓干细胞移植治疗肝衰竭
乙型肝炎病毒感染是严重影响人类健康的疾病，估计全球约有3.5亿慢性HBV感染者。在围生期和婴幼儿期感染的人群中，约25%在成年时将发展成肝硬化或肝癌。慢性乙型肝炎患者中，肝硬化失代偿的年发生率约3%，5年累计发生率约16%，乙肝肝硬化代偿期和失代偿期的5年病死率分别为14%~20%和70%~86%。全球每年约100万患者死于HBV相关的肝病，包括肝衰竭、肝硬化和肝癌等终末期肝病患者。我国属HBV感染高发流行区，据流行病学调查统计，我国估计约1.2亿人为慢性HBV感染，占全世界慢性HBV感染者的1/3，我国每年因慢性乙肝（包括肝硬化、肝癌）直接经济损失约9000亿人民币。
原位肝移植和肝干细胞移植均为终末期肝病有效的治疗手段，但前者因供肝来源有限、终身免疫抑制剂的应用等，使原位肝移植的临床应用受到限制，肝干细胞移植目前虽然尚不能取代原位肝移植，但因其取之于患者自身，不存在免疫排斥反应，且创伤小，治疗费用低，成为当前研究热点。骨髓干细胞是肝干细胞的重要肝外来源。骨髓干细胞在特定环境下可分化成骨髓源性肝干细胞 (bonemarrow derived liver stem cell，BDLSC)、肝细胞及胆管细胞，从而参与肝功能的修复和重构。大量研究证明，骨髓中确实存在能分化为肝细胞的干细胞，将其直接移植到肝脏，在肝脏微环境调节下可分化为肝细胞，可用于临床治疗。
近年来，人们已成功地开发了多种方法分离人类骨髓间充质干细胞，并在体外分化成为肝干细胞，且已发现肝细胞生长因子（HGF）是目前最强的肝细胞诱导分化剂。用高浓度的HGF、FGF4诱导体外培养的大鼠骨髓干细胞，RT-PCR检测到白蛋白及AFP的表达，免疫细胞化学也证实了经诱导的干细胞出现了AFP、白蛋白及CK8/18等肝前体细胞的特征性表达。Suzuki等报道，HGF可诱导白蛋白阴性的肝干细胞转变为白蛋白阳性的肝祖细胞。此外，在5%的淤胆血清时,骨髓干细胞在此病理筛选培养液中能够生存并选择性生长，而其他类型细胞则脱落凋亡，在培养第2周时形成肝细胞样集落，细胞表达胚胎时期肝细胞特征性蛋白，具有肝细胞特有糖原和尿素合成功能。有研究证明，当肝细胞的增殖发生障碍而肝脏又有再生需求时，肝卵细胞开始活化并进而向肝细胞演变，最终使肝脏得以再生。
近年来的动物和临床研究表明BDLSC的分化和增殖特点可以适用于肝病治疗。有学者首先在大鼠中发现一些骨髓细胞来源的卵圆细胞和肝细胞，研究者将雄性大鼠的骨髓细胞移植入经放射线致死照射的雌性大鼠，然后用2-乙酰氨基芴和四氯化碳损伤此受体鼠，此后在受体鼠的肝脏中发现了Ｙ染色体阳性的卵圆细胞和肝细胞。有学者对骨髓来源肝干细胞研究发现，THY 1(+)、β2微球蛋白(-)的骨髓细胞能分化为形态和功能都与肝实质细胞相同的细胞，分化细胞在超微结构上与肝实质细胞完全相同，而且在大鼠及人的正常肝脏及病肝中也可发现THY1(+)、β2微球蛋白(-)细胞的存在。所以THY1(+)、β2微球蛋白(-)的骨髓细胞被认为具有肝干细胞的特征。骨髓中造血干细胞一方面可以在病肝中分化为肝实质细胞，从而恢复肝功能，一方面又可以作为肝病基因治疗的载体。美国研究者将大鼠异体骨髓造血干细胞和成熟肝细胞分别通过门静脉注射入原位肝移植后发生排斥反应的大鼠肝脏，结果发现骨髓造血干细胞中约62%的细胞定位于肝脏，而成熟肝细胞只有约2.5%定位于肝脏，而且移植的造血干细胞表现出肝细胞和胆管细胞的特征。有学者报道人骨髓中的造血干细胞也可以分化为肝细胞，用ＤＮＡ特异性探针在一曾接受男性骨髓移植的女性病人肝脏中发现有Ｙ染色体阳性的肝细胞，提示骨髓造血干细胞可以定位于肝脏并分化为肝细胞。
分离后的BDLSC可以进行腹腔内或脾内移植，也可以经门静脉或肝动脉进行肝内移植等，每种方法各有其优缺点，目前临床治疗主要以肝动脉方式移植最为常用。
有临床研究表明，移植后12周食欲改善者75%（45/60）、体力好转者者53.3%（32/60）、腹胀减轻者46.6%（28/60），动态观察移植术后第1周、4周、8周、12周的血生化显示,谷丙转氨酶(ALT)由平均136.34IU/L降至59.55IU/L、总胆红素(TBIL)由平均122.88mol/L降至81.58mol/L、白蛋白(AL由平均27.53g/L升至32.13g/L。在60例移植患者中未发现严重并发症。
南京军区肝病中心经反复论证、组织中心医疗骨干外出学习培训和建立骨髓干细胞移植专用的、一流的净化治疗室后，已于2007年6月初成功开展首批终末期肝病患者自体骨髓干细胞移植治疗，至今累计完成治疗10余例，包括乙肝肝硬化、酒精性肝硬化失代偿期严重低蛋白血症腹水患者和各类肝衰竭患者，取得较好的近期疗效，患者临床症状及血生化指标均有不同程度的改善。未见明显的并发症。
随着对肝干细胞研究的深入，肝细胞移植、干细胞移植等治疗肝病的方法日益受到人们的重视。成熟的肝细胞移植有一定的局限性，即无法大量增殖和急需时使用。研究发现，胚胎干细胞、胎肝实质细胞在体内也可分化为成熟的肝细胞，由于流产胚胎的来源涉及伦理等问题，故限制其广泛应用。然而，BDLSC来源充足，可自体取材，增殖能力强，在体内外均有极强的向肝系细胞分化的能力，优于以上其他来源肝干细胞的种子细胞，将成为终末期肝病最有希望治疗方法之一。

自体骨髓干细胞肝脏内移植治疗晚期肝病
据www.hbver.com 5月13日报道，最近，我国首例接受自体骨髓干细胞肝脏内移植的患者来到北京军区总医院肝病中心复查。令人惊喜的是，患者进行干细胞移植5个月后，生化8项指标全部正常，硬化萎缩的肝脏比原来长大了一圈，患者腹水消失了，体重增加了，脸色红润了。干细胞在他的肝脏中已经生根发芽，具备了新的肝功能。这项技术的成功表明我国的干细胞移植又开辟了一个新领域，并有希望代替部分肝移植手术。
　　谈及自己的疾病，这位来自河南的42岁的汉子不堪回首。他两年前患肝硬化，全身黄疸，肝腹水、局部肝细胞坏死，生命垂危。当地医院建议做肝移植手术，但考虑到有风险且术后排异药品昂贵，他没有接受肝移植。2004年11月中旬，病人来到北京军区总医院，肝病中心副主任姚鹏博士经过详细检查发现，患者黄疸指数达到每升421微摩尔（正常小于22.5），凝血酶原活动度为34％（正常大于70％），肝脏明显萎缩，已经呈现肝衰竭症状。为了争分夺秒抢救患者，姚博士决定对患者施行自体骨髓干细胞移植。
　　目前临床上已有血管干细胞移植、神经干细胞移植、皮肤干细胞移植、心肌干细胞移植等，但肝脏干细胞移植国内还未见报道。医生首先从患者体内抽取少量骨髓，用高科技手段分离、提取骨髓干细胞，干细胞数达每毫升108以上，然后通过介入方法，插导管把干细胞注入肝脏。
　　干细胞有着与众不同的特性，能够多方向分化增殖，修复受损的组织细胞。它在肝内“落户”后，“入乡随俗”地生根发芽，逐渐枝繁叶茂，承担起病肝不能胜任的工作，并改良生病的土壤，促使病肝“回春”。目前肝病中心为国内外40多名患者进行了自体骨髓干细胞的肝脏内移植，年龄从20岁至71岁。根据移植8周的观察，大多数患者肝功能好转，谷丙转氨酶降低，总胆红素下降，白蛋白逐渐升高，肝脏功能明显改善。
　　姚鹏从2000年开始进行国家“863”课题“肝干细胞体外分化调控的研究”，经过基础实验、动物实验，终于在临床获得成功。他介绍说，目前这种技术在世界大多数国家还处于基础实验阶段，而我国尝试应用于临床，取得了令人鼓舞的效果。干细胞移植到肝脏后，新生的干细胞能“催醒”自身细胞“再生”，取代病肝功能，患者肝脏将逐渐得到恢复。这项技术风险小、痛苦少、费用低，适用于病毒、药物、酒精等多种原因造成的肝损伤，如慢性肝硬化、慢性肝衰、重症肝炎以及慢性肝炎的重症期等，但它目前还不能完全代替肝移植。

“自体骨髓干细胞移植”治疗肝病技术落户烟台传染病医院

山东新闻网烟台站讯(记者李斌通讯员姜雪梅) 记者日前从烟台传染病医院院获悉：该院引进的“自体骨髓干细胞移植“是目前世界上最前沿的医疗技术，在治疗各种慢性肝病方面具有显著疗效。该院是国内较早将该项技术用于治疗肝病的医疗机构之一，达到国内领先水平，填补了山东省自体骨髓干细胞移植治疗肝病技术空白。自2006年7月29日至今已成功开展介入手术20多例，取得了良好效果。此外，据该院医务人员介绍，医院多年来在肝病治疗方面不断探索，拥有的“三氧治疗技术”也很具特色。

（相关资料）

自体骨髓干细胞移植：

该项治疗技术是从患者自体抽取少剂量的骨髓，用先进的细胞分离技术分离出移植所需要的干细胞。然后通过介入方法把提取的干细胞注入病肝，干细胞在肝内分化成肝细胞。新生的肝细胞便承担起病肝不能胜任的工作，从而改变病人的肝功能。自体骨髓干细胞移植治疗肝病技术适应症主要为重症肝病、晚期肝硬化、重症肝炎以及慢性肝炎的重症期，也适合肝移植的多数病人，不仅有利于造血和免疫功能的恢复，而且能够替换坏死和损伤的肝细胞，自体骨髓干细胞移植不存在免疫排斥及伦理问题，是一种具有广阔应用前景的有效治疗手段，将把肝病的治疗带入一个全新的境界。

三氧治疗技术：

该技术采用医用纯氧为原料，连续生成不含有害氮氧化物的高纯度三氧，通过自血回输或直肠直接注入，在血液中生成少量过氧化氢和其他活性过氧化物，诱导血液中的各种细胞成分产生各种细胞因子和活性代谢产物，从而触发人体系列免疫应答反应，利用人体自身的免疫机能来攻击和消灭肝炎病毒，发挥三氧的抗病毒作用，促进血红蛋白的携氧能力，改善肝脏供氧，同时激活肝脏的自由基清除系统，提高肝脏的抗氧化能力。三氧治疗目前已经成为病毒感染性或传染性疾病、自身免疫性和某些代谢性疾病的首选或是辅助治疗方法。事实证明，目前医学上的难题——病毒性肝炎、爱滋病甚至是癌症，应用三氧治疗均可以取得可喜的治疗效果。同时，多年的临床应用还证实，三氧和过氧化氢临床应用的副作用远远低于一般的临床用药，在病毒性肝炎、脂肪性肝病、酒精性肝病和自身免疫性肝病等方面的治疗取得了非常满意的疗效。大量散发乙型肝炎和丙型肝炎的三氧治疗病例显示出良好的临床效果：肝炎病毒载量明显降低，临床症状明显改善，转氨酶和胆红素迅速降低，其治疗效果及副作用明显优于传统疗法。而且三氧治疗对于各类型肝炎，以及肝炎病程的各阶段均有良好的治疗效果，患者基本上没有任何的不良反应。

众所周知，自体骨髓移植费用少，风险相对较低。是否成为治疗终末期肝病的新方法？欢迎大家讨论，就此问题发表自己的观点。

该技术并不难，费用相对肝移植要低很多（10000-15000）。现在对于重肝患者或者终末期患者做一次血浆置换也要7-8千左右，况且血浆非常紧缺受到极大的限制。重要的是，这是个新兴技术，并没有达到广泛的证明。但目前由于肝源的紧缺和不菲的手术费用及其后的免疫排斥费用很多人并没有条件进行肝脏移植。所以我认为该项技术面临如下几个问题：第一、如何建立自己的适应人群最为重要，如有下列任何情况者不予行该项手术：
① 肝硬化终末期合并严重并发症（严重消化道出血，严重肝昏迷）。
②恶性肿瘤患者。
③生命体征不稳，如呼吸，血压，脉搏。
④年龄大于65及小于20。
⑤合并严重感染。
⑥心，肺，肾等脏器功能衰竭。
⑦ 严重出血性倾向，凝血功能极差（PTA<35%）。
⑧合并严重并发症（昏迷，大量腹水并腹膜炎）。
⑨其他严重状况。
第二、相对其他手术，在预后和病理方面是否有优势？不单单是观察肝功的各项指标如转氨酶、白蛋白、胆红素和PTA等。
第三、北京军区肝病中心的纳入标准为临床诊断为失代偿期肝硬化（Child C级），是否对于更早期的病人实行该项手术更有意义，而不必等到发展到C级？任何疾病到了终末期都是很难治疗的，像高血压出现靶器官损害就比较难了。

关于这一方面的文献比较少，下面是我搜集的一些文献。（其中的英文可以说关于此方面的所有英文文献了）
1 Development of cell therapy using autologous bone marrow cells for
liver cirrhosis
2 Fetal and adult liver stem cells for liver regeneration and tissue engineering
3 Lesson from the GFP/CCl4 model — Translational Research Project:the development of cell therapy using autologous bone marrow cells in patients with liver cirrhosis
4 Portal Application of Autologous CD133 Bone Marrow Cells to the Liver: A Novel Concept to Support Hepatic Regeneration
5 Long-term clinical results of autologous infusion of mobilized A dult bone marrow derived CD34 cells in patients with chronic liver disease
6 Phase 1 human trial of autologous bone marrow-hematopoietic stem cell transplantation in patients with decompensated cirrhosis
7 Safety and Efficacy of Autologous Bone Marrow Stem Cell Transplantation Through Hepatic Artery for the Treatment of Chronic Liver Failure: A Preliminary Study
8 肝硬化患者骨髓间充质干细胞的
体外培养及生长特性
9 骨髓干细胞分化为肝细胞的多种移植途径
10 自体骨髓干细胞移植治疗慢性肝衰竭研究
11 自体骨髓干细胞移植治疗慢性重症肝病50例
以上资料上传到mofile，有兴趣的战友可以先看资料，再发表意见，希望大家的评论有依据，不要想当然。
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这是中山三院关于这个方面的介绍，由高志良教授主持。
http://www.zssyhep.com/content.asp?news_id=62
自体干细胞移植术：晚期肝病治疗新技术
　　目前，对于严重肝功能衰竭还没有特效的治疗措施，近10年来的死亡率依然高达50％以上，肝移植是唯一得到公认的有效治疗方法，但其费用高昂，很多患者承担不起。且供体肝源有限，限制了肝移植的广泛应用。为探索行之有效的新技术，医学工作者进行了不懈的努力。
早在2000年，日本等国家的研究人员开始自体骨髓干细胞的相关研究，并在动物肝病模型中试验性使用自体骨髓干细胞治疗取得成功。去年，英国科学家利用肝病患者自体干细胞对患者进行治疗，并取得明显效果。
国内从2000年开始，以国家“863”课题“肝干细胞体外分化调控的研究”项目为起点，正式开展了肝骨髓干细胞治疗肝病的系列研究，并在临床获得成功。
我科于2005年9在全省率先在开展利用患者的自体骨髓干细胞移植技术治疗晚期肝病。至今治疗病人20多例，病人均为重型肝炎或晚期肝硬化，治疗总要效率达80％。许多患者在治疗后，凝血酶原时间缩短、血清白蛋白水平上升，黄疸逐步消退。
干细胞修复衰竭肝脏的技术是医生从患者的骨髓中抽去40～60毫升骨髓液，在体外分离获得100万个干细胞，然后通过肝动脉或门静脉回输到患者肝脏，干细胞在肝脏的内环境下，大部分转化为新生的肝细胞使肝脏功能得以恢复。
临床的初步成果给了我们很大的鼓舞，我科将继续进行骨髓肝干细胞的试验与临床研究，为广大重症肝病患者提供更好的治疗技术。

自体骨髓干细胞治疗晚期肝病临床意义
　　自体骨髓干细胞参与了多种器官系统的修复，通过人为地使自体骨髓干细胞在肝脏富集，并在肝脏的微环境中分化为有功能的肝细胞而可达到改善肝功能和抗纤维化的目的。因此，本项目可作为补充手段从以下几方面进一步提高患者的疗效。①改善达到肝移植标准但经济随力差的这部分患者的预后；②改善接近但尚未达到肝移植标准患者的预后。
骨髓肝细胞中有两类细胞，骨髓造血干细胞(HSC)和骨髓间质干细胞(MSC)可参与肝脏修复。HSC可自发或采用人工动员方式从骨髓迁移到肝脏，并参与肝的修复，但严重或晚期肝病时，这种修复机制已被消耗或受到抑制。MSC一般不能自发或采用人工动员方式进入肝脏，但一旦到达肝脏即可在数小时内转化为肝细胞。采用人工手段将MSC转移到肝脏可望帮助肝脏形态学修复、功能恢复和抗纤维化等。
目前国外开展自体骨髓干细胞治疗的报道涉及法国、德国、日本和意大利涉及疾病为心肌梗死、心肌再生等疾病。国内开展此项目的医院达数十家，有香港玛丽医院、南京市鼓楼医院、武汉协和医院、海军总医院、北京军区总医院等大型综合性医院，治疗的疾病涉及到心肌梗死、血管性疾病、多发性硬化、系统性红斑狼疮等。其中北京军区总医院首先将自体骨髓干细胞用于重型肝炎和肝硬化治疗，已治疗了40余例患者，据报道疗效非常满意。当然，自体骨髓干细胞治疗尚处于探索研究阶段，其疗效，特别是长期疗效的评估依赖更多和更深的研究。

Hepatology. 2007 Jan;45(1):213-22.
Bone marrow-derived cells express matrix metalloproteinases and contribute to regression of liver fibrosis in mice.Higashiyama R, Inagaki Y, Hong YY, Kushida M, Nakao S, Niioka M, Watanabe T, Okano H, Matsuzaki Y, Shiota G, Okazaki I.
Liver Fibrosis Research Unit, Department of Community Health, Tokai University School of Medicine, Isehara, Japan.

Liver fibrosis is usually progressive, but it can occasionally be reversible if the causative agents are adequately removed or if patients are treated effectively. However, molecular mechanisms responsible for this reversibility of liver fibrosis have been poorly understood. To reveal the contribution of bone marrow (BM)-derived cells to the spontaneous regression of liver fibrosis, mice were treated with repeated carbon tetrachloride injections after hematopoietic reconstitution with enhanced green fluorescent protein (EGFP)-expressing BM cells. The distribution and characteristics of EGFP-positive (EGFP(+)) cells present in fibrotic liver tissue were examined at different time points after cessation of carbon tetrachloride intoxication. A large number of EGFP(+) cells were observed in liver tissue at peak fibrosis, which decreased during the recovery from liver fibrosis. Some of them, as well as EGFP-negative (EGFP(-)) liver resident cells, expressed matrix metalloproteinase (MMP)-13 and MMP-9. Whereas MMP-13 was transiently expressed mainly in the cells clustering in the periportal areas, MMP-9 expression and enzymatic activity were detected over the resolution process in several different kinds of cells located in the portal areas and along the fibrous septa. Therapeutic recruitment of BM cells by granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) treatment significantly enhanced migration of BM-derived cells into fibrotic liver and accelerated the regression of liver fibrosis. Experiments using transgenic mice overexpressing hepatocyte growth factor (HGF) indicated that G-CSF and HGF synergistically increased MMP-9 expression along the fibrous septa. CONCLUSION: Autologous BM cells contribute to the spontaneous regression of liver fibrosis, and their therapeutic derivation could be a new treatment strategy for intractable liver fibrosis.

2007年发表在hepatology上文章：骨髓源性细胞可以表达基质金属蛋白酶导致肝纤维化的回缩。

骨髓干细胞向肝细胞分化方式的研究进展*★

刘彦，李昌平

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泸州医学院附属医院消化内科，四川省泸州市
646000

刘彦★，女，1982年生，四川省内江市人，汉族，泸州医学院在读硕士，主要从事肝病研究。
liuyan1982912-
2005@***

四川省教育厅资助课题（2003-
A027）*

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)03-00555-05

收稿日期: 2007-09-26 修回日期：2007-10-28 (07-50-9-5263/GW Q)

Differentiation mode of bone marrow stem cells into hepatocytes

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ:A cell mass from bone marrow can transform into oval cells and then differentiate into hepatocytes and biliary tract endothelial cells. It will bring a new hope for repairing irreversible damage of the liver.
ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ: To review several recent research results of the differentiation of bone marrow stem cells into hepatocytes.
ＲＥＴＲＩＥＶＥＳＴＲＡＴＥＧＹ: A computer-based search was conducted in Pubmed and HighWire for English articles about bone marrow stem cells for liver ailments published between January 1999 and June 2007 with the key words of "bone marrow stem cells，mesenchymal stem cells，hemopoietic stem cells， hepatocytes, hepatic fibrosis， hepatic cirrhosis".Meanwhile， Vip Database was undertaken to identify the relevant articles on bone marrow stem cells in the treatment of hepatic cirrhosis and hepatic fibrosis published between January 1999 and June 2007 with the key words of "bone marrow stem cells，mesenchymal stem cells，hemopoietic stem cells， hepatocytes, hepatic fibrosis， hepatic cirrhosis" in Chinese. The data were selected primarily， and then quotations of each article were checked.Inclusive criterion：The articles related to curing hepatic fibrosis and hepatic cirrhosis with bone marrow stem cells were selected. Exclusive criteria：the articles with repetitive research or Meta analysis were excluded.A total of 49 related English articles and 42 Chinese articles were collected, 34 literatures of them in accordance with the inclusive criterion were reviewed.Fifty-seven articles with old or repetitive articles were excluded.
ＬＩＴＥＲＡＴＵＲＥＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ:Of the 34 inclusive articles, 18 were on transplanting in vivo, 12 were about cultivation and induction in vitro and 4 were about the problems and prospect.
ＤＡＴＡＳＹＮＴＨＥＳＩＳ: Bone marrow stem cells include mesenchymal stem cells and hemopeietic stem cells, which are characterized by plasticity. Growth factors in vitro and special microenvironment in vivo could induce the differentiation of bone marrow stem cells into the precursor of hepatocytes and mature hepatocytes. Moreover, hepatic function could be improved obviously. The superiorities of bone marrow stem cells included affluent source, low cost, little injury, without embolism and graft rejection in autologous transplantation, which offer a new style for curing hepatic diseases. Bone marrow stem cells would be the cell resource of artificial liver.
ＣＯＮＣＬBＵＳＩＯＮ:Using bone marrow stem cells therapy for all kinds of refractory hepatopathy, such as hepatitis, liver cirrhosis and hepatoma, indicates a great achievement in clinic.

Liu Y, Li CP.Differentiation mode of bone marrow stem cells into hepatocytes.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(3):555-559(China) [www.***.com/***/ejournal/upfiles/08-3/3k-555(ps).pdf]

摘要
学术背景：骨髓中的某个细胞群具有转化为卵圆细胞，并进一步分化为肝细胞和胆管上皮细胞的潜能，为修复肝脏不可逆性损伤带来了新希望。
目的：对近年来骨髓干细胞向肝细胞分化的研究进行综述。
检索策略：应用计算机检索PubMed 及HighWire l999-01/2007-06 期间骨髓干细胞治疗肝病文章，检索词为“bone marrow stem cells，mesenchymal stem cells，hemopoietic stem cells， hepatocytes, hepatic fibrosis， hepatic cirrhosis”等，限定语言种类为英文。同时检索维普数据库1999-01/2007-06期间骨髓干细胞治疗肝硬化及肝纤维化文章，检索词为“骨髓干细胞，间充质干细胞，造血干细胞，肝细胞，肝纤维化，肝硬化”，限定语言种类为中文。对资料进行初审，并查看每篇文献后的引文。纳入标准：文章所述内容应与骨髓干细胞移植治疗肝纤维化、肝硬化的研究进展相关。排除标准：重复研究或Meta分析类文章。共收集到49篇外文文献和42篇中文文献，34篇文献符合纳入标准，排除的57篇为内容陈旧或重复文献。
文献评价：符合纳入标准的34篇文献中，18篇涉及骨髓干细胞通过移植在体内转化为肝细胞，12篇涉及骨髓干细胞通过体外培养、诱导分化为肝细胞，4篇涉及存在的问题与展望。
资料综合：骨髓干细胞主要包括造血干细胞和间充质干细胞, 其具有可塑性特性。体外通过生长因子，体内利用特定的微环境均可诱导骨髓干细胞分化为肝前体细胞和成熟肝细胞，并明显改善肝功能。从动物实验到临床研究都表明，骨髓干细胞具有的来源丰富、费用低廉、损伤小、自体移植不栓塞、无排斥反应等优点为治疗肝病提供了新思路，有望成为生物人工肝的细胞来源。
结论：骨髓干细胞治疗肝炎、肝硬化和肝癌等难治性肝病的临床应用前景非常突出。
关键词：骨髓干细胞；间充质干细胞；造血干细胞；肝细胞；肝纤维化；分化

刘彦，李昌平.骨髓干细胞向肝细胞分化方式的研究进展[J].***，2008，12 (3):555-559
[www.***.com/***/ejournal/upfiles/08-3/3k-555(ps).pdf]

0 学术背景

肝脏疾病是危害全人类的世界范围性的疾病，其发病率日益增加，发展到末期往往容易导致肝硬化甚至癌变。近年来对干细胞的研究为解决这个难题带来了新的希望。干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化能力的细胞，具有不对称分裂和无限增殖的特点，按来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞是分布在已分化的特定组织中的分化的细胞，其来源包括骨髓、血液、角膜、视网膜、牙髓、肝脏、皮肤、胃肠道和胰腺等。
骨髓干细胞是研究得最早、最深入的成体干细胞之一。1999年，Petersen等[1]首次报道大鼠骨髓中的某个细胞群具有转化为卵圆细胞，并进一步分化为肝细胞和胆管上皮细胞的潜能，这一发现掀起了骨髓干细胞移植修复肝损伤的研究热潮。

1 目的

传统的治疗手段包括肝细胞移植等治疗措施对其有一定的疗效，但很难以从根本上修复肝脏的不可逆性损伤。骨髓干细胞治疗肝病已经取得了瞩目的成绩，其治疗肝炎、肝硬化、肝癌等难治性肝病的临床应用前景非常突出。本文就近年来对骨髓干细胞向肝细胞分化方式的研究进行综述。

2 材料和方法

2.1 资料检索应用计算机检索PubMed 及HighWirel999-01/2007-06 期间骨髓干细胞治疗肝病的文章，检索词为“bone marrow stem cells，mesenchymal stem cells，hemopoietic stem ce lls， hepatocytes, hepatic fibrosis，hepatic cirrhosis”等，限定语言种类为英文。同时检索中国期刊全文数据库1999-01/2007-06期间骨髓干细胞治疗肝硬化及肝纤维化的文章，检索词为“骨髓干细胞，间充质干细胞，造血干细胞，肝细胞，肝纤维化，肝硬化”，限定语言种类为中文。对资料进行初审，并查看每篇文献后的引文。纳入标准：文章所述内容应与骨髓干细胞移植治疗肝纤维化、肝硬化的研究进展相关。排除标准：重复研究或Meta分析类文章。共收集到49篇外文文献和42篇中文文献，34篇文献符合纳入标准，排除的57篇为内容陈旧或重复文献。
2.2 检索方法符合纳入标准的34篇文献中，18篇涉及骨髓干细胞通过体内转化为肝细胞[1-18]，12篇涉及骨髓干细胞通过体外培养和诱导分化为肝细胞 [19-30]，4篇涉及存在的问题与展望[31-34]。

3 综合评价

3.1 骨髓干细胞
3.1.1 骨髓干细胞的分类及表面标志物骨髓干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs)是具有自我更新、高度增生和多向分化潜能的细胞群体，特定条件下具有分化并发育为各种血液和骨髓细胞的潜能。主要包括造血干细胞(hemopoietic stem cells，HSCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。HSCs是所有血细胞的原始起源细胞，它有多种特异的表面标志，如CD34、CD38、CD117、AC113、Thy-1、c-Kit等。MSCs是骨髓基质中主要的干细胞，参与基质微环境的组成和造血功能的调控，它表达高水平的CD13、SH2 (src同源区2)、SH3、CD29、CD71、CD90、CD100、CD166、CD120a、CD124、CD49b等，表达低水平的β2m－、CD44、CDW90，不表达造血系特征标志CD14、CD34、CD45、CD50。最近发现有分化潜能更强的胚胎干细胞样多潜能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cells，MAPCs)，还可能存在其他类型的干细胞。
3.1.2 骨髓干细胞的特性－可塑性某些组织干细胞除了能分化出该细胞系的细胞，还能分化产生其它细胞系有功能作用的子代细胞，这种现象被称为可塑性。传统观念认为干细胞有组织特异性，来源于某种组织的干细胞不可能跨越内、中、外胚层的限制，只能分化为该细胞系内的细胞。但近年来发现，BMSCs虽然数量非常少，但却有强大的自我更新能力，并可以定向或横向分化为多种组织细胞或组织前体细胞，如造血细胞、肝前体细胞、神经干细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、胰腺内分泌细胞、皮肤干细胞、Ⅱ型肺泡细胞、肾小管上皮细胞等。也正是因为BMSCs具备了该种特性才使其向肝细胞分化成为可能。
3.2 骨髓干细胞向肝细胞分化的方式 BMSCs可以通过体内转化、体外诱导两种方式向肝系细胞分化,前者包括异体移植和自体移植，后者包括直接诱导和分选后诱导。
3.2.1 体内转化体内转化即BMSCs或纯化后的干细胞通过异体及自体移植的方式可在体内转化为肝前体细胞或肝细胞。移植途径：门静脉、脾静脉、外周静脉、肝动脉、腹腔注射和肝内注射等。
异体移植：2005年Zhang等[2]将6～8周龄雄性BACB/C小鼠的BMSCs通过尾静脉注射和直接肝脏注射移植入雌性BACB/C小鼠体内，荧光原位杂交（FISH）、免疫组织化学（IHC）发现受者肝细胞中的表达Y染色体和ALB(血清白蛋白)。提示BMSCs体内能转化为肝细胞。2005年Sato等[3]分离人MSC/ CD34+细胞和non－MSC/CD34－细胞，移植入AA(烯丙醇)处理的鼠肝中。IHC显示AFP(甲胎蛋白)、ALB、CK19（细胞角蛋白）、CK18、AGPR(唾液酸糖蛋白受体)呈阳性。RT-PCR（检测到AFP、ALB。FISH发现人与鼠的染色体独立存在,无融合现象。上述结果只出现在有间充质干细胞的肝组织中且仅间充质干细胞基因组表达重排程序。提示随着肝脏的发育,骨髓干细胞分化为肝样细胞；MSCs是最具分化潜能的干细胞成分。2006年Kashofer等[4]用ccl4建立肝损伤模型，移植eGFP标记的HSCs入鼠肝。观察到eGFP（+）细胞呈肝细胞形态。RT-PCR检测到ALB、α-抗胰蛋白酶。IHC法在衍生的造血细胞中检出抗人线粒体抗体和抗核抗体，但eGFP（+）肝样细胞中不表达上述抗体。FISH发现eGFP（+）肝样细胞中表达鼠的Y染色体。并进一步试验证实肝样细胞中大部分基因来源于鼠。提示HSCs有与宿主肝细胞融合的潜能，由于不能保持人基因组特性，导致嵌合体细胞呈可变表型，且难以检测。2007年Oh等[5]将F334(DPPIV(-))大鼠分为3组，A组70%肝切除（PHX）造模，B组2-AAF(2-乙酰氨基芴)/PHX造模，A、B组先经有丝分裂抑制剂农吉利碱处理，再移植雄性F334[DPPIV(+)]大鼠的BMSCs，C组为对照。结果：A组肝脏中出现DPPIV(+)肝细胞;B组约20%卵圆细胞群表达供体标记物DPPIV和α-AFP,且有一部分细胞分化为肝细胞。提示骨髓干细胞可衍生为肝卵圆细胞并进一步分化为肝细胞，且细胞融合不能促进这一过程[6-7]。
自体移植：2006年Zhan等[8]等从切除左肝和中肝的小鼠的胫骨中提取BMSCs，用流式细胞仪富集Thy+CD3－CD45RA- HSC，以PKH26-GL体外标记后通过门静脉自体移植，2周后IHC检测发现肝板细胞间PKH26-GL标记的HSCs表达ALB、CK8。提示HSCs在部分肝切除后的肝再生环境中能分化为肝细胞，且参与肝组织再生这一过程。2006年Teraia等[9]对9名肝纤维化患者（血总胆红素< 3.0 mg/dL、血小板计数> 5× 1010 L-1、影像学检查无活动肝癌）进行自体骨髓移植(ABMI)，骨髓单核细胞取自髂骨，通过外周静脉移植。6个月后肝功能检测到血白蛋白和总蛋白升高;肝组织活检可见AFP及增殖细胞核抗原;无明显不良反应。提示ABMI对失代偿期肝硬化治疗有效。2006年姚鹏等[10]从60例慢性重症肝病患者(20～65岁)的髂后上棘抽取骨髓,分离纯化后经肝动脉介入移植入肝。移植后12周： ALT（谷丙转氨酶）、TBIL（总胆红素）、血氨水平逐渐降低； ALB、 PTA逐渐上升；食道静脉曲张未见明显改变。患者移植12周的生存率为95% ；移植后食欲改善、体力好转、腹胀减轻；未发现严重并发症。结论提示，自体骨髓干细胞移植治对肝衰竭患者的治疗安全有效。2007年 Fürst等[11]对13例即将接受大部肝切除(残余肝脏体积< 25%)的肝癌患者进行PVE(门静脉栓塞第Ⅰ、Ⅳ-Ⅷ肝段)刺激肝再生后移植自体CD133+BMSC入第Ⅱ、Ⅲ肝段，螺旋CT盲法检测肝脏和肿瘤体积。发现肝细胞生长率明显增高，准备手术的时间明显缩短，可接受手术比例明显增高。提示BMSCs移植联合PVE可刺激肝癌患者的肝细胞再生。
移植的影响因素：移植的成功依靠化学增活因素、黏附因子、细胞外基质（如:HGF、IL-3、IL-8、趋化因子SDF-1及其受体CXCR4以及MMP-9等）的相互作用[12-13]。体内环境和肝脏本身的微环境是促进骨髓细胞向肝细胞转化的关键因素[14]。移植细胞是否定居于肝脏、是否分化为正常肝细胞和卵圆细胞，与其移植途径和移植后的时间无明显关系，而与肝脏是否受损伤相关，它优先定植于受损伤的靶器官[15]。应用硝普纳扩张门静脉、脾静脉及移植后持续肝损伤刺激可促进MSCs向肝脏迁移和肝内的弥散分布等[16-18]。
3.2.2 体外诱导体外诱导即骨髓干细胞体外使用不同培养基与肝细胞或肝非实质细胞共同培养，加入不同的生长因子或特殊血清定向诱导可转化为肝前体细胞或肝细胞，可分为直接诱导和分选后诱导。
直接诱导：2005年Takeda等[19]将鼠BMSCs、多孔羟磷灰石(HC)、新鲜肝细胞共同培养。传代后的细胞植入低血白蛋白的大鼠腹腔，4周后检测到ALB和白细胞介素-6水平均升高。传代后的细胞植入“CCL4加苯巴比妥”建立的小鼠肝损伤模型中，发现减少的白蛋白完全恢复。提示将上述三维培养的细胞进行移植对受者有全身效应(通过增加血清中的细胞因子)和局部效应(通过与肝细胞的同向转化)。2006年施晓雷等[20]用FGF(成纤维细胞生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、OSM（制瘤素M）、EGF(表皮生长因子)诱导小鼠骨髓单个核细胞。在诱导12 d内观察到多极性的肝细胞样细胞。免疫组织化学：7 d内表达AFP并维持到第21天，但后期减弱；7 d内表达ALB和CK18，且不断增强； 14 d内表达TTR，且不断增强。免疫荧光染色定位：ALB表达于胞浆和胞膜，CK18表达于胞浆。过碘酸Schiff氏剂反应：细胞胞浆内出现大小不等的红染的糖原颗粒。提示通过诱导BMSCs，获得了有部分肝细胞形态结构和功能的肝样细胞。骨髓干细胞不经分选直接培养有利于保持细胞间的相互作用，保证细胞所处的微环境贴近体内，减少了分选纯化操作带来的人为影响。2006年Snykers等[21]以鸡尾酒方式诱导BMSCs，按时间依从性连续加入：成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素－转铁蛋白－钠－亚硒酸盐、地塞米松，成功地模拟出体内肝细胞分化的不同阶段的模型，可用于药物临床前试验和研究细胞器官的发育。2007年Chen等[22]将CCL4注射的小鼠肝脏进行培养，收集上清液，用于诱导鼠骨髓单个核细胞分化。观察诱导细胞呈肝细胞样变化。RT-PCR：第7天AFP、CK19基因表达；第14天ALB、CK18、HNF3β肝细胞核因子3β)基因表达；第21天TAT（酪胺酸胺基转移酶）表达。免疫荧光：第21天ALB、CK18、CK19、AFP基因表达。糖原染色呈阳性。提示骨髓单个核细胞在损伤肝脏条件培养液诱导下可分化为肝细胞，该方法对分化机制的研究有重要意义。
分选后诱导：2004年Shu等[23]密度梯度离心得到大鼠骨髓单个核细胞，贴壁24 h后低接种密度传代培养可获MSCs，在10 mg/L纤维连接蛋白为底物、HGF/FGF-4诱导下得到圆形细胞，表达ALB，不表达AFP。免疫磁株分离纯化HSCs，培养得到多边形细胞, ALB下降，AFP上升。两者均表达CKl8。提示MSCs可分化为成熟肝细胞样细胞，HSCs倾向分化为肝干细胞；CKl8是分化能力的前兆标志。2006年Lange等[24]GFP标记MSCs，纤维连接蛋白为底物，加入FLC（胎肝细胞）共同培养。流氏细胞仪分离GFP（+）、GFP（-）细胞， RT-PCR发现2周后表达AFP、CK18、ALB。提示MSCs和FLC共同培养的微环境不但有利于MSCs向肝细胞的分化扩增，也利于胎肝细胞的分化。间接共培养：2007年Jiang等[25]将第4代人骨髓来源的多能成体组细胞（ZHJ-MAPCs）和人肝细胞系L02仅培养液相通行间接共培养。先后于培养第1、3、5天检测到ALB、AFP、CKl8表达呈强阳性，CK19在各时间表达均呈阴性。直接共培养：将CFSE荧光(绿色)标记的第4代ZHJ-MAPCs与L02(密度均为1×107 L-1按照1∶1比例混合行直接共培养。5 d后用SABC-Cy3免疫荧光(红色)双标后在激光共聚焦显微镜下观察到胞质内呈黄色荧光ALB和CKl8的阳性细胞，而AFP阳性表达则仅出现在极个别细胞。结论提示，ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02行间接或直接共培养均能够诱导其向成熟肝样细胞定向分化，且直接共培养有提前趋势。2007年Aurich等[26]将MSCs与生长因子在人肝细胞菌种培养基中共同培养，检测证实了肝细胞形态标志及糖原储存、尿素合成、表达PCK1（磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶）等体外功能标志。将培养之肝样细胞移植入免疫耗竭的小鼠肝脏，发现细胞大部分聚集于门静脉周围的部分肝小叶内，且继续表达PCK1、糖原储存、间隙连接蛋白32、ALB、人肝细胞特殊抗原HepPar1。提示MSCs体外培养可以分化为肝细胞；局部整合后，移植细胞仍保持肝细胞的特征。
诱导的影响因素：培养环境，包括：温度、CO2浓度、培养基的成分、生长因子、适宜的血清浓度等在诱导分化中起决定作用[12,27-30]。选择适当的分离MSCs的方法，如：密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和贴壁筛选法等。体外培养的BMSCs的生长还受细胞之间相互作用的影响：接种密度过高会引起细胞之间的接触抑制而影响生长；接种密度过稀，细胞之间分泌的细胞因子不足，也会影响生长。还应注意换液的时间等。
3.3 骨髓干细胞的应用潜力和研究方向
3.3.1 骨髓干细胞治疗肝病的巨大应用潜力 Sell[31]提出有3种细胞可能参与成体肝脏细胞的更新与修复，前两种为处于分化终点的成熟肝细胞和肝前体细胞，但研究表明移植这两种细胞存在来源缺乏、治疗效果欠佳、免疫排斥等问题[32-34]，这就需要第三类细胞，即来源于骨髓的多能干细胞。BMSCs具备：①向肝细胞分化的多能性和专能性。②强大的增殖能力。③取材容易、损伤小、易于自体移植、无移植排斥反应。④便于外源性基因的转染和表达调控等。
骨髓干细胞移植治疗肝病的优点：①避免肝脏移植和肝细胞移植的排斥反应。②避免长期服用免疫抑制剂带来的负反应。③体外诱导扩增的肝细胞样细胞是生物人工肝的细胞来源。④早期利用骨髓修复肝损伤、改善遗传性缺陷组织的功能以及代替退行性组织，可极大地延长生存期。⑤回避了对胚胎干细胞应用的伦理争议，故临床应用前景非常突出。
3.3.2 未来研究方向尽管骨髓干细胞治疗肝脏疾病的临床应用已有个案报道，但目前国内外的研究仍然以动物实验为主，骨髓干细胞或骨髓源性的肝细胞要达到治疗水平的肝脏重建需要明确：①BMSCs直接移植和体外分化后移植的适应症及禁忌症？②BMSCs提取、纯化方式的统一标准？体外扩增的最佳条件?移植的最佳时机、最佳途径、最适细胞数?③移植细胞的归巢定位及促进因素？④移植的负反应?与传统治疗的配合?⑤骨髓源性肝细胞的的功能活性如何，能何种程度恢复肝功能？其稳定性如何，是否需要反复移植？其远期安全性如何，是否会转化为肿瘤细胞?⑥BMSCs向肝细胞分化的分子机制、开关基因和调空因子等。

4 结论

髓源干细胞具有极大的应用前景，对其可塑性的研究是一个相当有价值的课题，相信不远的将来人们利用骨髓干细胞能最终战胜肝脏疾病。

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