自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化失代偿期19例患者临床分析
武汉科技大学附属天佑医院 感染科 刘黎 李多云 周建等
[摘要] 目的 观察经肝动脉行自体骨髓干细胞移植对肝硬化失代偿期患者的治疗效果进行观察。方法 选择肝硬化失代偿期患者19例,抽取骨髓200ml,在体外分离纯化骨髓干细胞并制成10ml细胞悬液,经肝动脉将上述10ml细胞悬液通过介入方法移植入肝脏,其余2例分离脐带干细胞后制成100ml细胞悬液经静脉途径滴注治疗,分别在移植后第2、4、8周复查肝脏功能,观察实验室指标,临床症状及不良反应情况。结果 移植后第4周,血浆白蛋白明显升高(P<0.05),由(32.9±4.3)g/L升至(35.6±3.2)g/L，AST降低明显(P<0.05),由(74.3±20.3)U/L降至(48.3±13.8)U/L,ALT,总胆红素水平在移植前后无显著性变化，凝血酶原时间(PT)逐渐下降(P<0.05)，由术前(23.7±4.8)s 降至(19.3±3.1)s,甲胎蛋白逐渐升高(P<0.05)，由术前(12.5±5.6)ng/ml升至(24.7±9.7)ng/ml;干细胞移植对肝硬化失代偿期患者生存质量的影响：食欲改善,体力好转18（94.7%）例，腹胀减轻7例，腹水减少7例, 胸水减少3例，下肢浮肿减轻5例。在全部19例患者中术中未发生严重并发症，患者近期无不良反应出现。结论 自体骨髓干细胞移植治疗可使失代偿期肝硬化患者肝功能明显改善,治疗安全有效且副作用小,可作为中晚期肝硬化患者的临床治疗方案。
[关键词]自体骨髓干细胞；移植；肝硬化
Transplantation of autologous bone marrow stem cells via hepatic artery for 20 patients with decompensated cirrhosis
[Abstract]Objective To explore the effect of autologous bone marrow stem cell transplantation via hepatic artery in treatment of decompensated cirrhosis. Methods A total of 200ml bone marrow of ninety patients was aspirated from poster superior spine in aseptic conditions.After isolation and purification, the stem cells were transplanted into the liver via hepatic artery. After transplantation,clinical symptoms and laboratory data were recorded at the second, fourth, and eighth week. Results Four weeks after transplantation,levels of albumin was increased from (32.9±4.3)g/L to (35.6±3.2)g/L (P<0.05).AST was decreased from (74.3±20.3)U/L to (48.3±13.8)U/L (P<0.05).ALT and total bilirubin level was decreased, but no insignificant difference was found. Prothrombin time was decreased from (23.7±4.8) seconds to (19.3±3.1) seconds (P<0.05). AFP was increased from (12.5±5.6)ng/ml to (24.7±9.7)ng/ml (P<0.05). CHE was decreased, but no insignificant difference was found.Eight weeks after transplantation,appetite was improved in 6 cases, ascites was decreased in 7 cases, and abdominal distention was alleviated in 7cases, pleural effusion was decreased in 3 cases, lower extremity edema was decreased in 5 cases. There were no serious intraoperative complications In all 19 patients. Patients had no adverse reaction to the recent emergence. Conclusion After transplantation of autologous bone marrow, the liver function and general well-being of patients were significantly improved. This method was safe and effective in the treatment of patients with decompensated cirrhosis.
[Key words]Autologous bone marrow stem cells;Transplantation;Decompensated cirrhosis
各种原因引起的肝硬化是临床常见病、多发病,该病进入失代偿期后逐渐发展,最终可能导致肝功能衰竭。在治疗上一直以来并没有令人满意的进展,临床上主要仍以保肝对症及预防并发症为主,总体治疗效果不满意, 尤其是终末期肝病的治疗总体效果更差。近年来原位肝移植已成为终末期肝病最理想的治疗选择,但由于供体肝脏的紧缺,移植后的免疫排斥反应以及高额的医疗费用等限制了其临床应用。
干细胞定向分化为功能细胞并且应用于器官损伤的治疗,是目前细胞生物学以及生命科学的研究热点[1-2]。研究表明,在肝损伤及肝细胞再生的过程中[3],干细胞起着重要的作用,而骨髓干细胞是肝细胞的重要的肝外来源[4-6]。骨髓干细胞在特定环境下可分化成肝干细胞及肝细胞,从而参与肝结构和功能的修复和重构[7]。因此,本研究应用患者自体骨髓干细胞作为供体,在体外分离纯化后移植患者肝内,对该治疗方法的可行性及临床疗效进行探讨。
一 资料与方法
1.临床资料
19例均为2009年4月至2009年8月在本院感染科住院患者,其中女性1例,男性18例,年龄29-69岁,平均年龄49岁,其中乙型肝炎后肝硬化17例,酒精性肝硬化1例，原因不明型肝硬化1例,肝功能Child B级12例,Child C级7例,19例患者术前均存在肝硬化常见症状和体征,包括纳差、乏力、腹胀,同时经腹部B超或腹部CT、MRI检查明确诊断肝硬化并合并腹水,术前实验室检查包括血清谷丙转氨酶(LT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、血浆白蛋白(ALB)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(FIB),部分患者还检测了血氨、甲胎蛋白及血脂,患者入院后均行内科对症治疗,包括保肝、利尿及必要时腹水超滤回输等,所有治疗措施在患者知情同意情况下进行,签署《知情同意书》。
2.术前准备
移植前连续2d给予患者集落细胞刺激因子100mg皮下注射;术前1d行碘过敏实验,双侧腹股沟备皮,术前4h禁食禁水,移植当日对患者进行隔离,骨髓穿刺术前5-10h进行房间消毒。
3.骨髓干细胞采集及分离
取患者两侧髂后上棘为穿刺点,局部麻醉消毒,在无菌条件下,以18号骨髓穿刺针穿刺,抽取骨髓200ml,以7500U肝素抗凝,然后在本院干细胞实验室采用密度离心法进行骨髓干细胞的体外分离及纯化,得到细胞计数为3.2×109/ml-1.6×1010/ml,4℃冰箱存放,保存时间不超过3h。
4.移植方法
在DSA下经股动脉穿刺插管,置管于肝固有动脉进行造影,观察肝内血管情况及有无占位性病变。将待用的细胞悬液10ml于0.5h内经左右肝动脉缓慢注入;术毕拔管,穿刺点加压包扎后返回病房,穿刺侧下肢制动6h。
5.疗效观察
术后观察指标包括3部分：一是患者临床症状、体征；二是复查前述实验室指标；三是复查影像学检查。术后住院期间及出院后的观察期所选择的病例均未使用保肝药物及输注人血白蛋白等。术后2、4、8 周分别复查ALT、AST、TBIL、PT及ALB等指标，术后8周复查肝脏B超或CT。根据临床症状、体征和实验室检查结果,初步将患者疗效分为：有效(临床症状有1项以上减轻,体征有1项以上改善,实验室检查指标2项以上好转);无效(临床症状和体征没有改善，实验室检查指标无好转)。
6.统计方法
采用SPSS13.0软件进行统计,数据以均数±标准差( ±s)表示,组间比较用t检验,P<0.05,表示差异有统计学意义。
二 结 果
1.肝功能改变
患者在干细胞移植后第2周实验室指标开始出现变化，至第4周多项指标出现显著变化(见表1),其中AST均较术前降低明显(P<0.05),ALB较术前显著升高(P<0.05）；ALT和TBIL较术前也有所降低,但无统计学意义(P>0.05）
表1 自体骨髓干细胞移植前后患者肝功能变化情况( ±s)
组别
例数
ALT (U/L)
AST(U/L)
ALB(g/L)
TBIL(umol/L)
手术前
手术后
19
19
40.2±20.3
35.2±15.6
74.3±20.3
48.3±13.8*
32.9±4.3
35.6±3.2*
58.2±18.4
56.9±15.7
注：与手术前比较,*P<0.05
2. 凝血酶原时间、胆碱酯酶和甲胎蛋白变化
凝血酶原时间(PT)和甲胎蛋白(AFP)较术前明显下降(P<0.05）；胆碱酯酶较术前有升高,但统计学无意义(P>0.05）
表2 自体骨髓干细胞移植前后患者凝血酶原时间、胆碱酯酶和甲胎蛋白变化情况( ±s)
组别
例数
PT(s)
CHE(U/L)
AFP(ng/ml)
手术前
手术后
19
19
23.7±4.8
19.3±3.1*
75.5±21.3
80.2±17.4
12.5±5.6
24.7±9.7*
注 ：与手术前比较,*P<0.05
3. 临床症状及体征
自体骨髓干细胞移植后第4周开始大多数患者临床症状,体征明显改善，其中胸水减少3例;腹水减少7例;下肢浮肿减轻5例;食欲改善、体力好转6例；腹胀减轻7例，见表3。
表3 自体骨髓干细胞移植前后患者临床症状及体征变化
组别
例数
胸水
腹水
腹胀
下肢浮肿
体力、食欲
手术前
手术后
19
19
5
2
13
5
14
7
10
5
12
6
4. 不良反应
19例移植患者中未发现严重不良反应及并发症,术后低热有1例,24h内自行缓解,介入伤口渗血1例,经止血药物治疗后好转,无感染、肝区疼痛等并发症。
三 讨 论
肝硬化为临床常见病,一直以来缺乏有效的治疗手段。原位肝移植是目前比较根本有效的治疗方法,但受限于供体肝的缺乏,移植后的免疫排斥反应及高额治疗费用而难以普遍开展。肝细胞移植(Hepatocyte transplantation)和人工肝作为原位肝移植的替代治疗,同样存在上述问题。干细胞移植是当今世界上最前沿、最热门的医疗新技术之一。最近，俄罗斯、英国等先后宣布应用自体骨髓干细胞移植技术在治疗终末期肝病方面获得满意效果,引起了世界范围内的关注。被誉为“肝硬化治疗第二条终极途径”。
干细胞是一类具有自我更新和分化能力的细胞,在一定的环境下可分化为多种功能细胞,用于治疗肝硬化的干细胞根据其起源的不同,可分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞,后者包括骨髓源性干细胞,胰腺上皮细胞及神经干细胞等,其中骨髓源性干细胞又包括造血干细胞,间充质干细胞及骨髓干细胞,不同来源的肝干细胞虽然在形态、表面标志、功能及分化等诸方面有所差异,但均具有多向性演变的特性[8]。
目前许多研究表明骨髓干细胞具有向一些成体细胞(例如神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞及肝细胞等)分化的潜能[9-10]。大量研究也显示，在人肝硬化进展期过程中，肝细胞因端粒缩短导致肝细胞复制活动消失，此时产生于骨髓造血干细胞的卵圆细胞是肝细胞再生的主要来源，人的肝细胞和胆管细胞可由骨髓干细胞迁移并分化生成，如此可补充大量的肝细胞和胆管细胞[11-12]。骨髓源性干细胞诱导产生肝细胞的机制包括通过细胞融合的方式产生四倍体、六倍体和非整倍体肝细胞;另外,骨髓造血干细胞还可能通过启动快速高效的内源性肝细胞的增殖途径,进而改善内源性肝细胞的损伤也有大量研究表明,骨髓源性干细胞经诱导后产生的肝细胞是可以很好地替代受损肝细胞,进而恢复肝脏的功能。经集落细胞刺激因子预处理的骨髓造血干细胞注入受损的肝脏后,可在肝脏动脉中发现很高比例的骨髓源性的肝细胞，提示某些刺激因子的介入加速了骨髓对肝细胞的诱导过程。由此,在人干细胞提取纯化过程中选择合适的诱导剂,比如集落细胞刺激因子,可促进骨髓干细胞移植后向肝细胞的诱导分化。
为探讨骨髓源性干细胞对肝硬化病人的治疗作用，我们在临床上开展了自体骨髓源性干细胞经肝动脉移植治疗失代偿期肝硬化的研究。本研究发现，自移植后第 2 周实验室指标出现变化,至移植后第4 周，所有19例患者血清白蛋白水平均明显升高(P<0.05）,是化验指标中最为显著的变化；其次是AFP和凝血酶原时间均较术前显著改善(P<0.05）；AST于术后第4周亦出现下降,程度明显(P<0.05）。然而，ALT和血清总胆红素水平虽有下降,但无统计学意义(P>0.05） 上述结果表明，骨髓干细胞移植治疗后，患者肝脏功能明显改善，尤其以肝脏的合成及修复功能改善为显著,这些变化特别是血清白蛋白的升高是一般护肝治疗不可能达到的,失代偿期肝硬化属难治性疾病,故未设对照组,其结果也是可信的。此外，我们还观察到移植后大多数患者的临床症状明显改善,其中胸水减少3例;腹水减少7例;下肢浮肿减轻5例;食欲改善、体力好转6例；腹胀减轻7例。在19例移植患者中也未发现严重不良反应及并发症。
国内外的研究及临床应用均表明,自体干细胞移植治疗肝硬化效果出色[13-14],具有广泛推广价值,综合起来,主要有4大优点：①骨髓干细胞移植则来源方便，不受供体缺乏的限制，还可免除免疫排斥反应的发生[15];②效果明显：2-4周，食欲不振、乏力、腹水等症状显著减轻甚至消失；8-12周,干细胞开始分化,8项关键性生化指标可望恢复;3-6个月,随着新的肝细胞不断增加,受损肝组织得到修复,肝功能逐渐恢复,患者体征可获全面改善,步入康复阶段;③费用低廉：一般国内实施自体干细胞移植的费用平均在3-5万元,和活体肝移植相比,仅相当于其费用的1/10左右,而实质性改善状况尤其是远期效果并无特别差异;④技术风险小：手术本身过程并不复杂,加上采用的是介入微创手段,而且移植对象来自于患者本人,所以不会产生肝移植那样的排异反应。身体条件好些的,做完后观察数日即可出院。
我国是肝病大国，各种原因导致的肝硬化患者众多，在药物及原位肝移植治疗之外，自体骨髓源性干细胞移植治疗失代偿期肝硬化是一种全新而有效的新方法，其虽不能给肝病患者带来治愈性的效果，但是可以在很大程度上控制肝硬化的进展速度，提高肝硬化患者的生存质量。我们在本研究中采用的干细胞类型、选择的移植途径、使用的细胞数量均已在临床应用中得到有效证实，但仍有许多问题需要研究和思考，如骨髓源性干细胞中是否须进一步鉴别及纯化；分离纯化后的干细胞如果经过体外扩增后能否进一步提高疗效；干细胞经肝动脉途径移植与经门静脉途径、经脾途径、 经外周静脉途径及肝组织局部注射途径移植的优势对比；干细胞的数量及移植手术次数对临床疗效果有何影响，此外本项研究例数尚少，需要进一步增加病例数，这些都是我们下一步研究中需要进一步观察和解决的问题。
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