骨髓間充質干細胞治療缺血性腦卒中的機制
魏俊吉 王任直
骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）是間充質來源的多潛能干細胞，可以促進損傷、衰老器官的結構及功能修復，是當前再生醫學最有潛力的種子細胞。BMSCs在體外具有分化為肌肉、骨骼、脂肪及神經等多種組織前體細胞的潛能，近年來國內外對BMSCs治療缺血性腦卒中的研究較多 [1-3]，BMSCs移植的有效性目前已達成共識，然而細胞治療的機制依然是眾說紛紜。現將BMSCs治療缺血性腦卒中機制的最新研究進展綜述如下：
一、 BMSCs對腦血流灌注和血腦屏障通透性的影響
腦缺血及再灌注損傷均引起神經細胞凋亡及血腦屏障（blood-brain barrier, BBB）破壞，從而導致腦水腫等一系列病理損害。Cesario等[4]將小鼠來源的BMSCs移植到缺血大鼠的紋狀體，發現腦血流量和血腦屏障的通透性有明顯改善，在治療12d后即接近正常腦血流量。而且移植細胞量和腦血流灌注之間呈正相關的劑量依賴關系；治療組大鼠BBB的改善情況明顯好于對照組，BBB的改善同樣存在劑量依賴關系。這一結論與Polgar等[5]研究中劑量－行為學恢復狀況的依賴性關系極為相似。顯然移植的BMSCs發揮了重要作用。Chen等[6]應用BMSCs治療卒中后，腦組織血管直徑和微血管分支數量的增加也佐證了治療的有效性。但是新生血管的形成需要一個時間段，移植早期腦血流量的提高和BBB的改善是不能用新生血管形成來解釋的。這些結果是否和腦內同期升高的神經營養因子有關？是否BMSCs介導的神經營養因子挽救了已經損傷但活力猶存的宿主血管尚需進一步研究。
二、細胞分化及替代學說
細胞移植治療腦卒中的理性方案是將干細胞移植在缺血及損傷區周圍并分化、替代死亡的神經細胞。基礎研究已經證明細胞在體外誘導下可以分化為神經系細胞[7,8]。但是目前有關BMSCs腦內移植后的存活狀態和體內分化情況仍然存在爭議[9,10]。
絕大多數研究認為BMSCs在體內能夠分化為神經系細胞。Lee[8]將大鼠自體BMSCs移植4周仍發現細胞存活并分布于同側紋狀體、海馬以及雙側的新皮質。大約20％和15％的細胞分別表達神經元和星形細胞的標志物。但是作者應用單純培養基的體外研究則沒有發現BMSCs表達神經細胞的特異蛋白。這種現象被認為是細胞對周圍微環境不同因子的依賴作用。Lee同時發現移植的BMSCs在皮層和海馬有分化為神經元的趨勢，在胼胝體有分化為星形細胞的趨勢，研究結果提示自體BMSCs移植的微環境更有利于細胞的自身分化。少數研究[10,11]表明體內移植的BMSCs很少或者根本不能在體內分化為神經系細胞。Castro等的研究報告稱BMSCs在腦損傷組織內不能分化為神經元樣細胞。Lu[12]的研究中也沒有發現BMSCs能夠在宿主中樞神經系統分化為神經元和膠質細胞。Ohta[13]觀察到無論是否免疫抑制，細胞移植后的1－2周均能在脊髓損傷的部位觀察到移植細胞，但是BMSCs均沒有表達NF、GFAP、O4等神經細胞的特異蛋白；移植后3周BMSCs就幾乎全部“消失”了，因此細胞移植后的功能恢復和改善可能不是細胞與損傷組織的整合，然而移植細胞的消失至少表明其不可能或者說有極少的可能性會致瘤或者致畸，間接支持了BMSCs移植的安全性。
BMSCs移植后如果不能分化為神經系細胞或者僅有極少的分化比例能否起到有效修復組織損傷的作用尚值得懷疑。同時神經蛋白的表達并不意味著這些細胞具有成熟神經細胞的復雜功能，所謂的神經細胞標志蛋白也并非絕對是神經細胞特異性的，例如，nestin不但在早期的中樞神經系統組織中表達，而且在肌肉、心肌等其他發育細胞中亦有表達；神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE）是神經元特異蛋白，同樣可以被非神經元組織如小細胞及非小細胞型肺癌細胞表達[14]。僅僅依賴特異蛋白的表達判斷這種分化至少是不嚴謹的。
在哺乳動物的發生和分化方面，通過細胞融合可以產生活性細胞而發揮作用。Lee[8]認為自體細胞應該更容易與自我損傷細胞融合，但關于細胞融合的分子機制需要進一步去闡明。Cogle[15]報告了三例女性血液病患者，她們分別接受了男性供體的造血干細胞移植。她們去世后分析獲得的腦標本發現（分別為骨髓移植后的第22d、63d及6y）:移植細胞能夠分化為神經元、星形細胞及小膠質細胞。但是染色體分析沒有發現多倍體細胞，只有Y染色體陽性的細胞，結論不支持細胞融合現象。所以有關移植細胞可能和宿主腦進行了整合并代替損傷腦組織重建神經環路的學說目前尚沒有可靠的依據。
卒中可以導致腦室下區的原位神經干細胞轉化為新的神經元。然而，卒中后的1周內絕大多數新生神經元將相繼死亡，成活神經元替代死亡神經元的數目極少。因此干細胞移植到損傷區后可能是激活了宿主腦內源性的修復機制。
如此看來，移植細胞代替宿主損傷細胞的能力是有限的，只是提高了這一機制的可能性，而不是簡單的組織替代。
三、神經肽及神經營養學說
神經肽類物質和神經營養因子是神經組織內信息傳遞的重要成分，它們的神經信號傳導及神經營養作用是損傷腦組織修復不可或缺的。近年來，其在BMSCs治療腦卒中的機制研究中備受關注。
1、經典神經營養因子:
神經營養因子是一系列在結構上相關的多肽家族，經典的神經營養因子包括腦源性神經營養因子（BDNF）、神經生長因子（NGF）、膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）、神經營養因子3（NT-3）、神經營養因子4/5(NT-4/5)、肝細胞生長因子（HGF）、血小板源性生長因子（PDGF）、轉化生長因子（TGF）、成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子（EGF）、睫狀神經營養因子（CNTF）及胰島素樣生長因子（IGF）等。BDNF和NT-3可以誘導神經突起的生長和促進神經遞質合成關鍵酶的表達；NGF可以抑制細胞凋亡促進神經元再生；GDNF可以保護腦損傷后的神經元、減輕腦腫脹等；HGF促進細胞有絲分裂和組織形態構成。
BMSCs對損傷腦的環境變化比較敏感，其能夠提高神經營養因子表達可能是卒中腦功能恢復的關鍵，體外培養至第六代的大鼠BMSCs可以持續表達NGF和GDNF[16]。Ye[17]體外培養大鼠BMSCs的第3天既有GDNF的分泌，隨著培養時間的延長GDNF呈分泌遞增趨勢，但是GDNF的分泌能力受周圍微環境和自我生長狀態的制約。
神經營養因子能夠提高宿主細胞的抵抗能力，促進內源性前體細胞的生存、遷移和分化，此外BMSCs還可發揮旁分泌的作用，產生大量有益的細胞因子。
BDNF可以促進B淋巴細胞的反應從而提高細胞內游離鈣離子的濃度，進而改善細胞的免疫調節和抵抗力。Zhang[18]認為BDNF還能夠刺激少突膠質細胞的增生，可以減輕腦組織的炎性滲出及脫髓鞘病變。Lu[12]在脊髓損傷的研究中發現了移植細胞含有NGF和NT-3。Cesario[4]用ELISA方法研究表明，細胞移植后僅有GDNF、activin A、TGF-β、TGF-β2含量提高，其他因子升高極少或者根本測不到。Mahmood[19]利用BMSCs治療大鼠腦損傷顯示：治療組的NGF和BDNF明顯高于對照組；繼續進行的長期觀察發現：細胞移植3個月后可以仍可以提高BDNF的表達量，而對NGF沒有影響。
IGF-1是一個多肽生長因子，在體內和體外均有神經營養、抗凋亡、調節BBB通透性、調節神經元興奮性、促進神經發生和參與腦血管形成等作用。IGF-1的分泌受到細胞外信號變化的影響。Zhang[20]應用BMSCs治療腦缺血時發現，治療組IGF-1的分泌量明顯高于對照組。
BMSCs移植可以促進損傷腦中神經營養因子含量的增加，但是，不能排除是細胞移植后宿主腦自身細胞尤其是星形細胞激活了自身的神經營養因子分泌，因此確定營養因子升高的來源也是很重要的問題，而且目前對各種神經營養因子的研究結論尚不一致，有關神經營養因子的研究仍需更加深入。
2、腦鈉素（brain natriuretic peptide, BNP）:
作為一種神經肽，BNP和其類似物心鈉素一樣有較強的排鈉利尿和血管舒張作用，BNP可以減輕水腫、降低顱內壓力，從而改善腦的灌注。BNP還可以降低全身血管阻力，增強心臟輸出功能，提高收縮期腦的灌注壓力。此外，BNP可以通過降低蛛網膜絨毛顆粒內靜脈叢的壓力來增加腦脊液的重吸收。Song[21]通過實時PCR技術和放射免疫技術首次發現BMSCs在體外可以分泌和生理劑量相關的BNP,并檢測到移植后的BMSCs可以在宿主腦內分泌BNP。因此有可能經血管途徑應用細胞時，細胞在遷徙和滲透到腦組織之前已經發揮了有效作用，從而促進了損傷腦的功能恢復。
3、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)：VFGF是涉及血管發生和發展的肽類細胞因子,具有刺激新生血管形成和促進神經干細胞增殖的雙重效應，并在這二者之間起著重要的樞紐性作用。故又稱為亞類神經營養因子。Chen[16]將BMSCs和正常腦及缺血腦的提取物共培養，發現與缺血腦組織共培養的BMSCs分泌VEGF。缺血10d的腦組織提取物明顯促進BMSCs分泌VEGF。這一實驗結果提示移植的BMSCs可以促進卒中后腦血管的生成，而有利于卒中腦的功能恢復。
4、化學趨化因子（chemoattractant factors）：
腦組織缺血損傷后會釋放炎性介質和細胞因子，例如：IL-8、細胞內黏附分子1（ICAM-1）、及趨化因子巨噬細胞炎性蛋白1（MIP-1）、單核細胞化學趨化蛋白1(MCP-1)等，資料顯示BMSCs有炎性細胞的特點并像炎細胞一樣對損傷組織有靶向作用，BMSCs通過對細胞因子的反應，選擇性向損傷組織遷移，在損傷部位通過神經營養因子及神經肽發揮其治療作用[22]。
四、BMSCs對細胞間突觸結構及其信號傳導的影響
細胞移植后能否成為一個有功能的細胞單位？移植細胞如何和宿主細胞建立信號聯系？目前的文獻資料尚沒有研究結果能夠證實移植細胞和宿主細胞之間存在形態學上的必然的聯系。
正常腦組織中，星形膠質細胞在神經保護方面有重要作用，其不但為神經元提供能量物質，而且星形膠質細胞之間通過縫隙連接形成一個細胞間的網絡通路，這些通路連接主要有間隙連接蛋白43（Cx43）組成，通過縫隙連接星形細胞可以調節鉀離子和神經遞質的濃度。Gao[23]研究證明人類BMSCs產生的可溶性因子能改善星形膠質細胞間縫隙連接介導的細胞間聯系，研究同時證明Cx43的表達量和這種改善是一致的，BMSCs通過上調Cx43的水平來改善星形膠質細胞之間的聯系 。Li[24]在大鼠缺血后7d移植BMSCs，發現治療組的軸突標志物GAP-43明顯增高，而且缺血瘢痕減少，研究者認為是缺血區膠質細胞對移植物的反應性可以促進軸突的再生。
突觸結構是細胞之間遞質和信號傳導的重要方式，突觸素是突觸小泡膜上的特異性多糖蛋白，突觸素通過與Ca2 +的結合引起神經遞質釋放、信息傳遞和加工。突觸素的密度可間接反映突觸的數量、分布和密度。Wang[22]通過免疫組織化學方法發現BMSCs治療組的突觸素較之對照組有顯著增加，間接證明了突觸發生的存在。
Li[25]應用BMSCs治療大鼠腦缺血，發現治療組大鼠的缺血邊緣區軸突和髓鞘的厚度有明顯增加，胼胝體面積和紋狀體內白質束的數目也明顯增加，而且星形細胞的突起得到了重塑，并定向排列于缺血區。作者認為BMSCs治療卒中可以促進與大鼠神經功能恢復、增強及軸突重塑相關的少突膠質細胞和星形細胞的反應性。
五、BMSCs轉基因載體的作用
BMSCs不但是細胞治療的種子細胞，而且還是轉基因治療的良好載體。Naokado[26]以單純皰疹病毒為載體將成纖維生長因子－2（bFGF-2）轉入BMSCs，大鼠腦梗死24小時后移植轉基因細胞，結果顯示治療組FGF-2的分泌顯著增多，大鼠腦梗死的體積明顯減小，行為功能的改善也更為明顯。
Lu[12]將BDNF和報告基因GFP轉入BMSCs后移植到脊髓損傷動物模型，細胞在宿主體內不但可以高表達BDNF，而且可以促進損傷部位宿主軸突的生長，同時移植物可以提高宿主體內NGF、NT-3的分泌量。
六、展望
生物治療是藥物治療后的一個新興的疾病治療手段。造血干細胞應用于臨床治療血液病已經有40多年的歷史了，而關于非造血干細胞的臨床應用卻是幾度沉浮。近幾年，由于人們認識的提高、多潛能BMSCs的發現等使得干細胞治療又重新煥發了生機。并展示了一個令人激動的應用前景。
眾多研究資料證實了BMSCs在治療腦缺血方面的確切作用，目前尚沒有任何明顯毒、副作用的報道，但是細胞治療的長期安全性仍需進一步驗證。當前基礎研究的重點和難點就是BMSCs的細胞治療機制，如：細胞移植后是否能夠長期存活并無限增殖？體內的移植細胞及其子代細胞是否是有功能的細胞群體？移植細胞和宿主細胞之間是否建立了某種結構聯系？這種結構聯系的功能發揮如何等；近期備受推崇的神經營養學說最終是哪些營養因子在發揮作用？這種營養支持是移植細胞還是宿主在發揮主要作用？所以客觀地講，BMSCs治療腦缺血走向臨床之路盡管前途光明，依舊道路曲折。我們仍需要更多的基礎和臨床前期研究以闡明細胞治療的機制。
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