臍血移植基礎和臨床研究進展
對于同胞間HLA相合供者的不足，近十余年來已將供者擴展到HLA相合的無血緣關系人群。由于無血緣關系骨髓移植HLA相合程度要求很高，雖然國家花費巨大的人力和物力建立了造血干細胞資料庫，仍然只有部分人群能受益于無關供者骨髓移植。1988年Gluckman E報道首例臍血移植(UCBT)成功，證明了臍血移植臨床應用的潛能以來，國外很多國家建立了公共臍血庫以解決供者來源的不足，同時廣泛開展了臍血造血干細胞移植臨床研究工作并取得了長足的進展。到2006年為止，估計全世界庫存臍血約250，000份并已有近萬例兒童和成人患者接受了同胞或無關UCBT[1，2] 。國內自90年代初先后在北京、廣州、濟南、天津、上海等城市建立了規模的臍血庫，目前庫存臍血總量約4萬份，估計全國開展UCBT超過300例，主要為無血緣關系UCBT。以往多數臨床研究表明，4-6位點相合的臍血能重建兒童血液腫瘤患者的造血和免疫系統，取得較好的治療效果。然而，臍血移植在成人中的應用由于其很高的移植相關死亡率而受到限制。近年的臨床資料表明，在大體重兒童和成人以及非惡性疾病中均取得了非常好的效果，且臍血移植的數量在逐年增加。雖然臍血移植在臨床上取得了較大的進展，但由于臍血細胞數量少和其免疫的不成熟，UCBT植入率低和造血恢復延遲以及免疫重建緩慢而增加患者感染和早期移植相關死亡為其突出問題[1]。
UCBT在兒童和成人allo-HSCT中的地位
UCBT在兒童allo-HSCT中的地位已確立，無論是同胞還是無血緣UCBT臨床療效均與相應的同胞和無血緣BMT療效相當。前者的結論來之于Rocha等對同胞UCBT和BMT的比較研究[3]，他們分析113例HLA相合兒童UCBT和2052例HLA相合兒童BMT的臨床結果。重點比較了兩組移植方式的急、慢性GVHD發生率、植入率和生存情況。發現UCBT組未能植活的比例要高于BMT組, GVHD發生率在UCBT患者無論是急性GVHD還是慢性GVHD均低于BMT組，3年生存率分別為64％和66％，無顯著統計學差異。
對于兒童無血緣UCBT，Rocha等[4]回顧性地分析了541例兒童急性白血病患者應用無血緣UCBT和無血緣BMT的多中心研究結果。單因素分析表明，UCBT患者中性粒細胞和血小板恢復較BMT患者延遲；大于II度急性GVHD和慢性GVHD的發生率在UCBT和T細胞去除BMT患者較BMT患者明顯降低；而UCBT患者早期TRM較高。100天后復發率、死亡率在3組病例相當。2年復發率、總生存率及無病生存率（DFS）在3組病例無明顯的差異。為了進一步闡明UCBT的優缺點，Barker等[5]應用前展性、隨機方法進行配對研究了兒童HLA 0－3位點不合的無血緣UCBT和HLA完全相合的無血緣BMT患者中性粒細胞和血小板恢復、GVHD發生和生存情況。結果表明UCBT患者中性粒細胞恢復延遲，而血小板恢復時間兩組相似，中性粒細胞植入率在UCBT組和BMT組亦無顯著差異。盡管UCBT組臍血與受者HLA差異較大，但與BMT相比并沒有加重GVHD的產生，早期死亡率亦無明顯差別，且2年的生存率亦無明顯差異，分別為53％和41％。這項研究說明盡管UCBT組HLA差別較大，但與配型相合的BMT相比，無論在植入率、GVHD和生存率方面均無顯著差異，表明臍血完全可以替代無血緣關系骨髓進行兒童造血干細胞移植。
影響UCBT在成人廣泛應用的主要原因是臍血中有核細胞數量少而增加移植失敗的風險和造血延遲恢復，因為臍血中有核細胞的數量只為骨髓移植物的1/10。因此，早期臍血移植只是作為高危血液系統腫瘤治療的最后選擇。最近來自歐洲和北美的兩個多中心大宗病例報告詳細分析了成人急性白血病無血緣BMT和無血緣UCBT的臨床研究結果。歐洲資料[6]比較了1998-2002年682例成人急性白血病無血緣關系造血干細胞移植的臨床結果，其中UCBT組 98例，BMT組 584例。多變量分析顯示UCBT發生急性GVHD的風險較低, 但中性粒細胞恢復明顯延遲。兩組慢性GVHD發生率、TRM、DFS均無顯著性差異。因此該研究作者提出，對于成人白血病患者，若無HLA匹配的骨髓供者，UCBT是一種可以接受的治療手段。北美資料[7]比較了國際骨髓移植登記組（IBMTR）的600例成人白血病進行無血緣HSCT的臨床結果，該研究得出與歐洲類似結論。
臍血細胞數量和HLA相合程度對臍血移植效果的影響
限制臍血移植臨床應用的主要因素是其有核細胞數量。多數研究證明低臍血細胞數量與低植入率、高TRM和低生存率有關，尤其在大體重兒童和成人臍血移植患者。例如，Wagner 等[8]報道如果輸入CD34+細胞數少于1.7 x 105/kg,則TRM超過70%。2006年歐洲臍血移植協作組（Eurocord）推薦臍血細胞數量應高于3 x 107/kg[2]。
除臍血細胞數量之外，HLA相合程度也明顯影響臍血植入和患者生存。Eurocord 報道隨著HLA不相合程度的增加，其移植相關死亡率增加。紐約血液中心（NYBC）分析大宗臍血移植病例，其HLA 6/6~3/6位點相合，發現HLA不合程度與移植效果關系密切[9]。然而紐約血液中心（NYBC）報道在HLA 6/6位點相合的臍血移植病例，移植效果與所輸有核細胞數量（0.7->10 x 107/kg）無明顯相關性[9]。作者認為，這可能是HLA相合補償了臍血數量的不足。因此對于臍血的篩選，既要考慮臍血細胞的數量又要考慮HLA配型的相合程度。HLA配型不合程度越大，所需細胞數量就越多。因此Eurocord建議[2]當HLA分別為 6/6、5/6、4/6相合時，TNC應分別大于3 x 107/kg、4 x 107/kg 和5 x 107/kg,這樣可獲得“滿意”的單份臍血。對于這種臍血選擇的建議，仍然需要前瞻性的研究來證實。
解決臍血植入失敗和造血重建延遲的策略
如上所述，影響臍血植入的主要因素除與細胞數量有關外，供受者HLA相合程度對植入亦有重要影響。雖然臍血允許HLA 1－2個位點不合，但HLA高匹配程度可能改善臍血干細胞的植入率。因此要改善臍血干細胞植入，最重要的是選擇HLA盡可能相合的臍血、增加臍血干細胞的數量和促進造血細胞增殖和分化。
1.選擇有核細胞數及CD34+細胞數較高的臍血：在眾多的影響因素中，臍血有核細胞和CD34+細胞數量是移植成功的關鍵。在考慮HLA相合程度后，Wagner 等[8]建議HLA 0－2位點不合的多份臍血可供選擇時，應首先考慮有核細胞或CD34＋細胞的數量。
2．體內促進造血細胞成熟：除HSC數量外，臍血干細胞本身“不成熟”的特點也可能是其植入延遲的原因之一。已證明臍血較骨髓造血干細胞分化為巨核細胞的時間明顯延長[10]，早期應用細胞因子IL-11可加速造血重建。早期（0-7天）應用G-CSF可明顯加速中性粒細胞造血恢復，并可能提高生存率[11]。我們在臍血移植+1天開始應用重組人IL-11可明顯加快血小板恢復，血小板>20 x 109/L的時間由一般報道的40-60天縮短為平均約25天[12]。另外由于造血干細胞分化成熟受其他細胞的調節，可否通過體內或體外應用非造血細胞或免疫細胞促進臍血干細胞成熟而加快造血重建有待研究，這些包括成熟血細胞、淋巴細胞、抗原呈遞細胞和間充質干細胞等。
3.臍血干細胞擴增：通過體外擴增臍血HSC，提高輸注的HSC量，將有望縮短造血重建的時間，但到目前為止有效的擴增體系尚未建立。較有前景的也許是Hox基因產物，其中HoxB4最為引人注目。通過逆轉錄病毒感染使HSC過表達HoxB4 mRNA，臍血HSC能擴增100倍以上，如果用TAT-HoxB4(一種可溶性HoxB4蛋白)處理純化的HSC，也能使HSC擴增100倍[13]。體外與間充質干細胞滋養層共培養也能增加造血干細胞的擴增效果。
4.雙份臍血同時移植：為提高臍血移植的細胞數，I期臨床試驗嘗試了同時輸注兩份HLA部分相合的臍血移植。明尼蘇達大學Barker等[14]報告了23例高危組惡性血液病患者接受2份UCBT的臨床研究結果。患者中位年齡24歲（13歲–53歲），采用清髓性預處理方案，兩份臍血總有核細胞中位數為3.5 x 107/kg。可評價患者21例，臍血植入時間23天，II°–IV°、III°–IV° aGVHD發生率分別為65%和13%；1年DFS為57%，其中緩解期移植者1年DFS為72%。我們的研究也證明雙份臍血移植是安全的，可以克服成人患者因單份臍血細胞數不足而無法進行臍血移植的問題[15,16]。
5.加入低劑量半相合CD34+細胞：Fernandez 等[17]研究表明臍血聯合低劑量單倍體CD34+細胞可加速臍血植入速度，中性粒細胞恢復快，感染發生率明顯低。早期以單倍體細胞植入為主，后逐漸被臍血取代，100天內90%的患者轉變為完全臍血嵌合體。4年DFS高達65-82％。
6．骨髓腔內臍血注射：動物實驗和臨床研究證明，臍血直接骨髓腔內注射可增加植入率和縮短植入時間，從而提高臍血移植的生存率。Ibatici A 等[18]應用臍血骨髓腔內直接植入的方法進行了29例成人臍血移植，中位年齡38歲，HLA配型18例4/6、10例5/6、1例3/6位點相合，中位有核細胞數量為2.3（1.4-4.2）x 107/kg。多數患者采用經典CY/TBI預處理方案。所有生存超過14天的患者達到100%臍血植入，中性粒細胞和血小板植入的中位時間分別為+23和+38天，較常規臍血移植植入時間明顯縮短。只有8%發生I-II度急性GVHD。由于隨訪時間短，尚不能評價其生存優勢。
7．減低預處理強度：減低預處理強度或非清髓已用于高齡、長期化療和合并重要器官功能受損的患者。Brunstein 等[19]應用環磷酰胺/氟達拉賓預/200cGY預處理措施進行110例臍血移植（多為雙份）治療成人進展期惡性血液系統疾病，其3年生存率可達到45%。Ballen 等[20]應用氟達拉賓/馬法蘭/ATG預處理方案進行21例雙份成人臍血移植，100天移植相關死亡率僅14%，1年無病生存率高達67%。這些研究結果表明對于不適合清髓預處理的患者，非清髓預處理后進行臍血移植也可取得較好的治療效果。
加快臍血免疫重建的策略
無論何種干細胞來源，HSCT后都必須重建供者來源的免疫系統。由于臍血免疫重建相對緩慢，感染發生率高，早期移植相關死亡率高。因此除移植后加快造血重建促進中性粒細胞恢復以減少細菌和真菌感染外，加快UCBT后細胞免疫重建亦是減少感染提高患者生存率的關鍵。HSCT后早期免疫重建階段T細胞主要來自供者胸腺后T細胞，這些細胞已經成熟，具有抗原特異性和功能特異性。但成熟T細胞的過繼免疫并不是靜止的，它們可以通過與宿主微環境相作用而受到調節（如胸腺或胸腺外細胞因子IL－2，IL－7，IL－15等）。HSCT后持久的T細胞免疫重建依賴于造血干細胞從頭發育而來，發育過程與胎兒T細胞的發育相同，所需時間也類似。胸腺微環境對T細胞的這一發育過程至關重要。化療、放療、GVHD、受者年齡增大等均能損傷胸腺微環境，影響HSCT后免疫重建。
由于UCBT免疫重建相關的HSC在數量上明顯減少和在質量上發育不成熟，從而導致免疫重建延遲或削弱[21]。臍血中胸腺后T淋巴細胞幾乎全是naïve T，而naïve T細胞很難活化，造成UCBT后T細胞對特殊抗原的應答能力比成人移植物的記憶T細胞弱。除T細胞外，臍血中抗原呈遞細胞（APC）也與成人不同。UCBT的這些免疫重建特征不僅意味著對HLA不相容的耐受性更強，也意味著UCBT受者對病原體的應答能力減弱，感染發生率增高，感染死亡的危險性大。但這并不意味著移植物抗白血病（GVL）效應的減弱，恰恰相反，UCBT后白血病的復發率很低，可能與臍血細胞介導的較強的GVL效應有關。
近年基礎研究和臨床實踐提出了加速臍血移植后免疫重建的策略，其措施包括：1）加速胸腺前T細胞發育，可通過增加HSC或淋巴前體細胞（CLP）數量。小鼠接受致死量照射后聯合移植CLP及HSC比單用HSC能顯著降低CMV的感染率，與移植大量胸腺細胞相比，少量CLP就可顯著提高小鼠抵抗CMV的能力[22]。這一技術的難點在于獲得足量的CLP，可能的解決方案是激活Notch通路，使HSC擴增并產生更多的CLP。2）改善胸腺功能，補充胸腺分泌的細胞因子如IL－7。小鼠模型中給予IL-7能顯著提高移植后胸腺細胞的生成，但IL-7同時可促進成熟T細胞擴增，有增加GVHD的風險[23]。3）應用胸腺保護劑角化細胞生長因子（KGF）。KGF是來源于間充質細胞的纖維母細胞生長因子家族成員，與上皮特異性受體結合。在實驗模型和臨床試驗中給予KGF可減少預處理毒性，使用后胸腺細胞產量增加，淋巴細胞恢復加速，GVHD發生減少[24]。4）減少預處理毒性以減輕胸腺微環境損傷。Duke大學[25]比較了非清髓和清髓UCBT的免疫重建情況，發現非清髓UCBT髓系和淋系恢復更快、更穩定。可能是由于非清髓方案損傷較輕或非清髓方案GVHD發生率低，從而更好的保護了T細胞增殖發育所需的外周和胸腺環境。5）盡量減少移植物中T淋巴細胞損失：移植物中的T細胞有促植入作用，它可以加速HSC分化形成胸腺前T細胞的能力，這些細胞在胸腺微環境的作用下進而產生有免疫功能的T細胞。雖然臍血中T細胞多為naive T細胞，但在移植早期的免疫重建中亦發揮重要作用。因此減少移植物中T細胞的損失對加快UCBT后的造血和免疫重建具有積極意義。因此預處理應用抗胸腺細胞球蛋白一方面可促進臍血干細胞植入，但去除了臍血中的T細胞對免疫重建有負面影響，可使免疫恢復延長數月[26]。
造血干細胞移植的臨床選擇
近十余年UCBT的發展充分證明，該治療方法已成為無血緣BMT的一種有效替代方法，顯示出了巨大的應用潛力，成為造血干細胞移植領域的重大進展之一。通過大宗病例分析，已確立UCBT在兒童和成人異基因造血干細胞移植的地位。因此建議臨床需要進行造血干細胞移植的患者如果在需要的時間內找不到合適的無血緣關系供者，可采用HLA 1-2位點不合的UCBT。由于雙份臍血移植可明顯提高臨床效果，臍血移植的適應癥還可以放寬。因此Sanz MA 建議[27]對于無合適親屬供者的患者，應同時查詢臍血庫和骨髓庫，以便能及時找到合適的供者，這樣可彌補無血緣供者查詢時間過長而延誤患者的治療時機。近年由于國內造血干細胞資料庫容量的擴大和較成熟開展了HLA配型不合的親屬間造血干細胞移植，已使較多患者能找到較合適的供者，但UCBT仍有較大的應用空間。由于臍血查詢方便和易于獲得的獨特優點，對于病情不穩定而急需進行移植的患者是最好的選擇。今后應著重改進治療策略，使臍血能迅速且持久植入，并研究加速UCBT免疫重建的措施，降低移植相關死亡率，這樣可使UCBT的臨床效果會有較大的提升空間。相信在未來5-10年的時間里UCBT的臨床應用會更加廣泛。
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