1910年,Davis首次把胎膜(羊膜+绒毛膜)用于移植取得成功,尔后羊膜移植被广泛用于各种手术,作为烧伤皮肤移植片、人造阴道粘膜鞘、皮肤外伤覆盖物及头部、腹部、骨盆和耳鼻喉手术中防止组织粘连的底物[2]。1940年,DeRotth首次报道了应用羊膜覆盖治疗眼表上皮缺损,但上述研究未引起重视和推广。直到1995年,Kim和Tseng在兔化学烧伤模型的角膜表面进行羊膜移植,产生角膜上皮化和角膜型角蛋白的表达,羊膜移植逐渐引起眼科医师的重视。羊膜的组织生理特性决定了它适合于眼表疾病的治疗。羊膜组织可以在-80℃的环境中保存数月。羊膜不表达HLA-A,B或DR抗原,移植后几乎不引起免疫排斥。另
外,羊膜组织被认为有抗微生物的特性,降低了术后感染的发生率。抗纤维形成[8]和促进细胞移行、分化也是羊膜的一个显著功能。本文主要对羊膜的组织生理特性、移植作用机理以及目前在眼科的应用范围作一综述。
1 羊膜的组织和生理学特点
人羊膜是从细胞滋养层衍化而来,是人类两层胎膜的内层。正常羊膜薄而透明,无血管,厚度为.02~0.05mm。光镜下羊膜分5层:(1)上皮层:大部分羊膜上皮为单层立方形,而胎盘胎儿面羊膜上皮为柱状;(2)基底膜:由狭窄的无细胞网状纤维构成,厚度不一;(3)致密层:薄而致密,羊膜的张力决定于此层的结构。此层与基底膜连接紧密,而与下面的纤维母细胞层相接较松。致密层由网织纤维组成,HE染色呈淡伊红色均质带,一般无细胞,对母体的细胞浸润有一定的阻力;(4)纤维母细胞层:是羊膜厚度的主要组成部分,
由疏松纤维母细胞和网状纤维组成;(5)海棉层:来源于胚外体腔上皮网状纤维,由波浪状网织纤维束构成,象弹力纤维一样具有伸展性。临床上一般将羊膜分为二层:上皮层和基底层。
羊膜上皮细胞的表面有许多微绒毛,基底部有细胞突起伸入基底膜形成足突样结构。电镜下,细胞突起与基底膜之间通过张力细丝(半桥粒结构)形成紧密连接。基底膜主要由部分无定形物质和部分微纤维构成。细胞质内富含胞饮小泡,胞质丰富,含有大量内质网池和高尔基体,核仁外形不规则,核膜富有凹痕,提示核分裂活跃。上皮细胞的超微结构与羊膜的特殊功能密切相关,正是由于这种结构的存在决定了
羊膜可以行使其3个主要功能:作为覆盖上皮、作为分泌活跃的上皮和有强大的细胞间和经细胞转运功能。
2 羊膜移植的作用机理
2.1 促进上皮化 眼表上皮细胞正常增生和分化有赖于正常上皮下基质的存在,基底膜促使上皮细胞移行,增强上皮细胞的粘附性,推动上皮细胞的分化,同时防止上皮细胞凋亡。羊膜是一层薄的、半透明的组织,形成胎膜的内层,含有人体中最厚的基底膜,由发育安全的Ⅳ、Ⅴ型胶原和板层构成,这些都是构成人体基底膜的主要成分。把羊膜和角膜、结膜基质中含有的Ⅳ型胶原类型和板层结构进行比较,发现除结膜上皮基底层和羊膜基底膜含有的Ⅳ型胶原α2与角膜上皮基底层含有的是Ⅳ型胶原α5不同外,其余成分基本相同,提示羊膜基底膜和眼表上皮基底层组织成分相近。羊膜移植机制不同于其他粘膜移植,在唇粘膜、鼻粘膜移植中移植的是活的上皮细胞,羊膜移植移植的是基底层,通过羊膜移植,为病变组织提供了健康的上皮下基质环境,促使正常上皮化的发生。另外,羊膜细胞产生许多生长因子,如成纤维细胞生长因子、细胞生长因子等,这些均可促使上皮化的发生,但值得一提的是经冷冻保存的羊膜细胞生长因子分泌显著减少,一定程度上削弱了羊膜的促上皮化的功能。有研究证实羊膜还有抑制前列腺素活性的作用。深入实验证明人羊膜能在鸡受精卵绒毛膜尿囊上诱导产生上皮细胞,这项成果为羊膜移植用于临床奠定了基础。
2.2 抑制纤维形成 瘢痕形成和纤维化是各种不同病理损伤所产生的伤口愈合后的共同结果,它包括由细胞-细胞间、细胞-基质间通过各种细胞因子相互作用来调节的复杂生理过程。其中,控制纤维发生的原始型细胞因子是转移生长因子-β(TGF-β)。它的异常表达与纤维形成和炎症过程有关,TGF-β最主要的作用是刺激不同的细胞外基质蛋白合成和积聚,促进蛋白酶抑制物的生成,调高细胞粘附分子的浓度,抑制基质降解蛋白酶的合成,总的来说,这些作用使细胞和基质相互作用增强,导致伤口愈合中的纤维形成。TGF-β
有3种不同的同分异构体,它们是:TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,分别由不同的基因编码,被哺乳动物细胞系统所表达。这些TGF-β在成熟的多肽片段中有很高的结构等同性,在培养基中也有相同的生物作用。已证实TGF-β1、TGF-β2被人类眼前段所表达,它们通过与受体结合而起作用,TGF-β的Ⅱ型受体(TGF-βRⅡ)与TGF-β的作用有关。在伤口愈合过程中,基质成纤维细胞通常转化为肌成纤维细胞,这个过程叫作成纤维细胞活化。成纤维细胞活化过程也可在由撕裂或穿通伤所致的角膜伤口愈合中发现。这个生化过程与肌成纤维细胞的形态学改变等同,包括公认的细胞内收缩装置的表达。这些收缩装置有细胞内F-肌动蛋白微丝束,由α-SM、α-辅肌动蛋白、肌球蛋白、α5β1-整合素的膜受体(如高亲合力的纤维结合素受体)组成。在所有的细胞因子中,TGF-β是最重要的α-SM调高因子,同时通过角膜成纤维细胞调高α5β1-整合素的表达,是成纤维细胞活化的标志。羊膜能降低TGF-β信号系统的表达,从而阻止成纤维细胞活化过程,最
终减少瘢痕形成。实验证明,当培养人角膜和角膜缘成纤维细胞与羊膜基质接触后迅速关闭它们对TGF-β和TGF-βRⅡ的表达,从而使相应的α-SM、α5β1-整合素产生减少,使纤维形成减少。成纤维细胞和羊膜基质接触后关闭对TGF-β的表达类似以往的关于哺乳动物上皮细胞接种到基底膜上后关闭对TGF-β的表达的报道,推测上皮和间充质细胞能识别一定的基质环境。如果改变它们的天然基质环境,将会启动TGF-β信号系统。羊膜基质成分与眼表上皮基底成分相近,因此对TGF-β的表达起抑制作用。
2.3 低抗原性 用荧光染色技术在新鲜收集或试管内培养的人羊膜上皮细胞内均未发现HLA-A,B,C和DR抗原以及β2-微球蛋白的表达。进一步用更敏感的放射生物技术来检测,可发现少量HLA-A,B,C和DR抗原以及β2-微球蛋白的表达。Adinolfi等为了检测羊膜上皮细胞所产生的少量抗原是否会引起排异反应,选取7个正常成人进行皮下羊膜移植,观察6周,未检测到肉芽组织形成、炎性细胞浸润、新生血管形成等提示急性排异产生的现象。实验和临床观察证明绒毛膜具有很强的抗原性,而羊膜的抗原性很低,作为自体移植可以完全被接受,用来异体移植则反应很小。
2.4 抗微生物性 许多学者观察到羊膜移植术后感染发生率远远低于唇粘膜、鼻粘膜移植术,认为羊膜有抗微生物特性。羊水中含有丰富的溶酶体、转移因子、7S免疫球蛋白和β1c、β1a球蛋白等具抗微生物特性的物质,但这些物质在羊膜中均不能检测到。Talmi等认为羊膜强大的粘附能力和移植后与植床的紧密接触(通过弹力蛋白-纤维连接)是羊膜具有抗微生物特性的主要原因,通过紧密接触,宿主自身的防御机制得以发挥作用,从而降低术后感染的发生率。
3 移植羊膜片的制备
3.1 从剖腹产的健康人[排除含有人类免疫缺陷性病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)及梅毒]胎盘上采取,剪成2cm×2cm,用4.0×106U·mL-1庆大霉素液清洗,放入900g·L-1甘油瓶中,脱水24h后,转移至另一甘油瓶中,密封放入4℃冰箱中保存。使用时用生理盐水冲去甘油,泡入4.0×106U·mL-1庆大霉素BSS液中,复水30min后使用。
3.2 取剖腹产孕妇的胎盘,产前母体行血清学检察,排除含有HIV、HBV、HCV及梅毒。剖腹产后立即取其胎盘,在层流罩下,用含50mg·L-1青霉素、50mg·L-1链霉素、100mg·L-1新霉素、2.5mg·L-1两性霉素B的Earle平衡液清洗胎盘。取其羊膜,平铺于带有0.45μm微孔的硝酸纤维素滤纸上。将覆有羊膜的滤纸,切成3cm×4cm的团块,在术前贮藏于-80℃、含有Dulbecco改良的Eagle基质和甘油(二者比例为1∶1)的无菌瓶内备用。术前将容器于低温下解冻后使用。
4 羊膜移植在眼科的应用
4.1 羊膜移植可以替代结膜瓣覆盖和睑缝合术用来治疗持续性眼表上皮缺损经药物治疗无效的病例,由于羊膜组织是透明的,移植后对视力影响很小,尤其适合患眼仍有良好视力的患者。角膜溃疡累及基质层时,用多层羊膜覆盖比较有效。值得一提的是新近穿孔或肿胀严重的角膜用羊膜移植来治疗效果不佳。
4.2 翼状胬肉切除术后可用羊膜移植来替代自体结膜移植修复缺损。据统计,羊膜移植后翼状胬肉复发率(10.9%,限于原发性翼状胬肉)低于巩膜暴露疗法(45%),但高于自体结膜移植(2.6%)。尽管自体结膜移植看来是最安全的方法,在某些病例如伴随弥漫性结膜病变或球结膜必须被保留以备将来行青光眼滤过手术,羊膜移植不失为一种合理的选择。
4.3 角膜干细胞缺乏常伴有角膜上皮结膜化,未经治疗可以引起角膜血管化、瘢痕产生、钙化、溃疡形成、融合和穿孔。对于这类患者,行传统的角膜移植效果很差,因为板层或穿透性角膜移植仅仅提供临时的角膜覆盖上皮,不能恢复干细胞功能。在弥漫性角膜干细胞缺损的病例中,干细胞移植(自体或异体)是角膜上皮重建的必要步骤,但单纯行干细胞移植,由于术后免疫排异、瘢痕产生、干细胞生存的微环境缺乏等原因,成功率很低。羊膜移植提供健康的基底膜,与干细胞移植联合应用,曾经成功地被用来治疗弥漫性干细胞缺损和严重的眼表疾病,如Stevens-Johnson综合征、进展性眼瘢痕性天疱疮、化学和热烧伤等。同样地,自体干细胞和角膜上皮可以在含有羊膜的培养基中培养后用于角膜表面重建。
4.4 Fujishima等[27]最近把羊膜移植用于青光眼滤过手术中并联合小剂量丝裂霉素C来抑制瘢痕形成和促进滤过。术中在巩膜瓣下置羊膜移植片,术后14眼中13眼滤过良好,眼压得到控制。长期以来,滤过手术后眼球外改变(结膜下瘢痕化)是手术失败的主要原因,抗纤维药物、丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶常被用来抑制瘢痕形成,但并发症的发生率也随之增高。羊膜具有抗纤维化的特性,从理论上来说是一种安全有效的移植物,在青光眼滤过手术中起到抑制瘢痕形成的作用。
4.5 滤过手术后滤过泡破裂可产生低眼压、浅前房和脉络膜脱离,严重的引起滤过泡感染甚至眼内炎的发生。发生这种情况需要及时处理,修补方法包括冷冻固定术、Nd:YAG激光、氰丙烯盐酸胶、纤维组织胶和手术修补。Budenz等最近报道用人羊膜来修补破裂的滤过泡,在5例患者中均取得成功。

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