臍帶間充質干細胞治療脊髓損傷臨床分析
劉靜1 韓冬梅1 王志東1 薛梅1 朱玲1 閻洪敏1 郭子寬2 王恒湘1
【摘要】 目的 觀察臍帶間充質干細胞（UC-MSCs）鞘內注射治療脊髓損傷（SCI）的臨床效果及安全性。方法 對2008年1月至2010年10月收治的22例SCI患者，給予UC-MSCs鞘內注射治療，細胞數1x106個/kg.次，1 次/周，4次為1個療程，其中4例接受兩療程，1例接受3療程，余均接受1 個療程。采用美國脊髓損傷協會制定的脊髓損傷神經功能評分標準(ASIA標準)對患者治療前后神經功能進行評定，采用國際神經修復學會脊髓損傷功能評價量表（IANR-SCIRFS）對患者治療前后日常生活活動能力進行評定。結果 22例患者中13例有效，9例無效。不完全性SCI患者有效率達81.25%，完全性SCI的6例患者均無效。有5例有效的患者接受了2～3個療程治療，療效均有進一步的提高。有效患者多表現為運動和/或感覺功能改善，大小便控制能力增強。22例患者治療后1個月與治療前兩組間比較痛覺、觸覺、運動、日常生活活動能力評分有明顯升高(P < 0.01)。治療后常見的不良反應有頭痛（1例），腰痛（1例），均在1～3天內消失。隨訪3個月～3年，無治療相關不良事件發生。結論 UC-MSCs鞘內注射治療是安全的，可以改善大部分不完全性SCI患者的神經功能，提高這些患者的生活質量。
【關鍵詞】 臍帶間充質干細胞；脊髓損傷
Clinical analysis of umbilical cord mesenchymal stem cells treating spinal cord injury
LIU Jing1,HAN Dongmei1,WANG Zhidong1,XUE Mei1,ZHU Ling1,YAN Hongmin1,GUO Zikuan2,WANG Hengxiang1
1 100142 Department of Hematology, General Hospital of the Air Force,Beijing
2 100850 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing
【Abstract】 OBJECTIVE To observe the clinical effect and safety of
基金項目：首都發展基金項目（2007-2033）；國家高新技術研究發展計劃（863項目）（2007AA 022454）；國家重大新藥創制基金（20092x09503-019）；軍隊臨床高新技術重大項目（2010gxjs049）
作者單位：100036 北京，空軍總醫院血液科（劉靜 韓冬梅 王志東 薛梅 朱玲 閻洪敏 王恒湘）；100850北京，北京放射與輻射醫學研究所（郭子寬）
通信作者：王恒湘，Email：wanghengxiang123@yahoo.com.cn
umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) in treating spinal cord injury (SCI) by intrathecal injection. METHODS From January 2008 to October 2010,22 admitted patients with SCI were given UC-MSCs by intrathecal injection,at a dose of 1 x 106 cells/kg body weight once a week,4 times as a course.Besides 4 cases received 2 couses and 1 cases received 3 couses,others received 1 couse.American Spinal Injury Association (ASIA) scoring system and International Association of Neurorestoratology SCI Functional Rating Scale (IANR-SCIFRS) were used to evaluate SCI patient’s neural function and ability of daily living. RESULTS Among 22 cases,13 cases were effecttive,9 cases had no response. The effective rate of incomplete SCI cases was 81.25%,all of 6 cases with complete SCI had no response. There were five effective patients received 2～3 couses therapy,effects were further enhanced. In most effective patients,motor and/or sensory functions improved,bowel and bladder control improved. One month after therapy compared with before therapy, 22 patient’s algaesthesis,tactile sensation,motion,activity of daily living scale were obviously increased (P < 0.01). After therapy,common adverse effects were headache (1 case),low back pain (1 cases),all disappeared within 1～3 days.Follow up 3 months to 3 years,no treatment-related adverse events happened.CONCLUSION UC-MSCs therapy by intrathecal injection is safe,and can ameliorate most of incomplete SCI patient’s neurological function,as well as improve these patient’s quality of life.
【Key Words】 umbilical cord mesenchymal stem cells,spinal cord injury
SCI是一種較為常見的神經系統嚴重創傷, 常導致癱瘓及大小便失禁,手術、藥物、康復理療治療效果欠佳。UC-MSCs來源于臍帶，易于獲取，體外能夠大量擴增，低免疫原性，具有橫向分化的潛能，在適當的條件下可向外胚層的神經細胞分化。臨床上，采用人UC-MSCs治療SCI國內尚無報道，我們采用UC-MSCs鞘內注射治療22例SCI患者，取得一定療效，現報告如下。
資料與方法
一、 研究對象
對象選擇自我科2008年1月至2010年10月收治的22例SCI患者，男17例，女5例，年齡19～51歲，平均年齡33歲；損傷部位：頸髓4例，頸髓+胸髓2例，胸髓7例，胸髓+腰髓2例，腰髓7例；損傷時間2～204月，平均56個月。損傷原因：車禍8例，高空墜落7例，砸傷及跳水損傷各2例，摔傷、脊髓炎后遺癥、脊髓栓系綜合征各1例。對患者的治療及風險如實告知，患者對治療均簽署知情同意書，治療方案經醫院醫學倫理委員會批準。所有患者均具有干細胞治療適應癥：無發熱、感染，無凝血功能及心、肺、肝、腎等重要臟器功能障礙。術前對患者進行總體評估：體格檢查，ECG、脊髓損傷部位MRI檢查，血、尿、便常規、肝腎功、凝血象、手術感染8項。
二、方法
1. UC-MSCs制備：按參考文獻提供的方法[1]，稍加改良后進行UC-MSCs制備。簡言之，經知情同意及感染源檢定后收集臍帶，去除外膜和動靜脈，將臍帶剪成0.5cm3大小的組織塊，加入等體積0.2%I型膠原酶，37℃消化過夜。次日，加入兩倍體積的0.05%的胰蛋白酶，37℃消化1小時。2000rpm離心10分鐘收集細胞，計活細胞數。將細胞懸浮于人MSC無血清培養基（杭州百威）中，按106細胞/cm2底面積接種于塑料培養瓶中。1周后出現由數十個形態類似于成纖維細胞組成的集落。加入0.05%胰蛋白酶消化，并按6000細胞/cm2底面積進行傳代培養。利用流式細胞術測定細胞表型，常規感染源檢定后，收集細胞用于治療。或收獲細胞放于-80℃冰箱凍存備用,用前，在37℃環境下快速復蘇,24～48小時培養，收獲貼壁生長的細胞供臨床應用。
2. UC-MSCs注射：入院第3或第4天開始給患者行腰穿，鞘內注射UC-MSCs，1次/周，4次為1個療程。按診療常規進行腰穿，將UC-MSCs 10 mL(1x106/kg.次)+地塞米松5mg在10 min內緩慢注入蛛網膜下腔，拔針，敷以無菌輔料，囑患者去枕平臥6 小時。
3．輔助治療：系統康復鍛煉。
4．評估標準[2]：（1）采用美國脊髓損傷協會制定的脊髓損傷神經功能評分標準(ASIA標準)對患者治療前后神經功能進行評定：檢查頸2到骶4～5神經支配的身體兩側各自28個皮節區痛覺和觸覺，按消失、減退、正常分別給予O、l、2分，痛覺、觸覺總分均為112分；檢查頸5到骶1神經支配的身體兩側各自10個肌節中的關鍵肌，按肌力0～5級分別給予0～5分，總分為100分；（2）采用國際神經修復學會脊髓損傷功能評價量表（IANR-SCIRFS）對患者治療前后日常生活活動能力進行評定，包括上、下肢、軀干、全身運動功能、括約肌功能、肌張力、泌汗、皮膚營養、疼痛，最高分48分為正常。分值越低表示神經功能缺損越嚴重，日常生活活動能力越差；（3）損傷完全性評定：完全性損傷：損傷平面以下包括骶4～5既無感覺也無運動功能；不完全性損傷：損傷平面以下包括骶4～5有感覺（或）運動功能。
5．不良反應及并發癥觀察：觀察治療中及治療后有無發熱、腰痛、頭痛、頭暈等不良反應。
6．隨訪 對患者治療后3個月、半年以及之后每半年隨訪1次，觀察病情變化。
7． 統計學分析：采用SPSS 11.5軟件包進行統計處理，計量資料以 SD表示，行數據配對t 檢驗、成組資料t 檢驗分析，P < 0.05為差異有顯著性意義。
結果
一、臨床療效：
1．22例患者中13例有效，總有效率為59.1%，9例無效。有5例有效的患者接受了2個或3個療程治療，療效均有進一步的提高。有效患者多表現為運動和/或感覺功能改善，大小便控制能力增強。
2. 22例患者ASIA評分及IANR-SCIRFS評分顯示：治療后1個月與治療前兩組間比較痛覺、觸覺、運動、日常生活活動能力評分有明顯升高(P < 0.01)，見表1。
3．16例不完全性SCI患者中13例有效，有效率達81.25%，3例無效，治療結束后1個月與治療前兩組間比較，痛覺、觸覺、運動及日常生活活動能力評分有明顯提高(P < 0.01)，6例完全性SCI患者均治療無效，見表2。
4.SCI部位存在軟化灶的6例患者中5例治療無效，無效的患者2例為不完全性SCI，3例為完全性SCI。
5.有效的13例患者損傷的時間2～204個月，平均59個月，無效的9例患者損傷時間4～136月，平均51個月，兩組患者損傷時間無顯著差異（P > 0.05）。
6.不良反應及并發癥：UC-MSCs治療中及治療后，患者的生命體征均平穩。1例治療后感頭痛，1例治療后感腰痛，未經特殊處理，1～3天后癥狀消失。無發熱及其他不良反應。
7.隨訪 13例有效患者中9例治療1月后療效不再增加，3例治療3月后療效不再增加，1例治療1年后療效不再增加；9例無效患者病情無變化；所有患者無UC-MSCs治療相關的不良事件發生。
討論
SCI是致殘率最高的疾病之一，最常發生于青壯年，導致病人損傷平面以下感覺、運動功能喪失和/或大小便失禁,不僅給病人造成極大的痛苦,同時也給家庭和社會帶來沉重的負擔。脊髓損傷可分為外傷性和非外傷性兩種，前者占90%以上。本組患者除2例疾病引起外，20例為外傷所致，其中車禍、高空墜落為主要外傷原因，占75%。目前SCI修復面臨的主要問題是：原發和繼發性神經元死亡，大量的軸突變性和彌漫性脫髓鞘；損傷后膠質瘢痕形成阻礙了軸突生長；局部炎癥反應和神經營養因子、神經生長因子的缺乏，以及SCI后損傷區微環境中大量的抑制因子的產生(如硫酸軟骨素蛋白多糖、髓磷脂相關糖蛋白等)，極大地阻礙了損傷神經的修復。手術、藥物、物理康復等治療都不能有效地解決這一世界級難題。間充質干細胞（MSCs）具有來源廣泛、取材容易、具有強大的增殖能力、在體外長期培養過程中始終保持其多向分化潛能，在適宜的條件下能分化為神經元及神經膠質細胞，還可分泌多種神經營養因子（NTFs）如神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）、膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）[3,4]，且在異基因移植中不存在免疫排斥反應[5]，也不涉及醫學倫理問題，為中樞神經系統損傷提供了新的治療途徑。
動物實驗已證明MSCs具有促進神經修復的作用。將大鼠MSCs注入脊髓損傷大鼠蛛網膜下腔，損傷部位的MSCs明顯高于未受損部位，一些MSCs可分化為神經元和神經膠質細胞，促進脊髓損傷的修復，且在體內無免疫排斥[6,7]。Yang等[4]將人UC-MSCs移植到完全性橫慣性SCI大鼠的損傷部位，大鼠的運動功能得到顯著改善，病變周圍皮質脊髓束再生軸突和神經微絲的數目顯著增加。目前MSCs治療SCI所取得的研究成果多局限于動物模型，在臨床上的應用仍處于起步階段。Pal等[8]將體外擴增的自體骨髓MSCs（1x106個/kg體重）鞘內注射給30例SCI患者，隨訪1～3年無不良事件發生。Ichim等[9]將異基因體外擴增的臍帶血CD34+細胞及UC-MSCs分別于損傷后5月、8月、14個月鞘內注射給1例腰髓損傷患者，該患者肌力、排便及性功能改善，神經疼痛減輕，無副作用發生。我們將體外擴增的UC-MSCs鞘內注射給22例SCI患者，總有效率為59.1%，有效患者增加療程數療效有一定提高；對不完全性SCI患者有效率達81.25%；但對完全性SCI患者無效；損傷部位如果存在軟化灶的患者總體療效欠佳，6例患者中僅1例有效。治療過程安全，隨訪3月～3年無不良事件發生。
MSCs可來源于骨髓、臍帶以及臍血。骨髓MSCs含量低，104～105個骨髓單個核細胞含有1個MSC，患者要經歷采髓過程，還需要等待3周左右體外培養擴增；人臍血含有MSCs，但傳代培養困難，不易大量獲得；人臍帶華爾通膠含有豐富的MSCs，在體外能夠大量擴增，還可將其凍存，應用前復蘇，短時間內即可收獲足夠量的細胞。Shetty等[10]比較骨髓、臍帶、臍血獲得的MSCs，這三種來源的MSCs具有同樣的MSCs表面分子表達：CD73+、CD105+、SSEA4+、CD29+、CD44+、HLA ABC+，而臍帶MSCs（UC-MSCs）與臍血MSCs（UCB-MSCs）不表達與移植排斥相關的HLA DR，在混合淋巴細胞檢測中呈免疫抑制，并抑制T細胞增殖，異體移植該細胞可產生免疫耐受性[5]，表明其為一類免疫缺陷細胞，異基因移植不會發生免疫排斥反應。基于上述，我們選擇人UC-MSCs治療SCI。
鞘內注射的MSCs進入脊髓組織時要通過腦脊液-腦屏障， 其通過的機制可能包括：(1)脊髓損傷各種炎性因子和血管活性物質釋放，使腦脊液-腦屏障的通透性增加；(2)脊髓損傷部位對MSCs具有一定的趨化作用。關于UC-MSCs治療脊髓損傷的作用機制尚不完全清楚，可能有：(1)UC-MSCs向病變部位組織滲透融合，一些移植的MSCs在新的環境下表達神經細胞表型，替代損傷細胞，重建神經通路，達到恢復神經功能的目的；(2) UC-MSCs分泌的各種NTFs，如NGF、BDNF、GDNF等，支持神經細胞生存，誘導內源性神經細胞再生，促進神經纖維在損傷部位再生 [11,12];(3)通過細胞間的接觸、可溶性細胞因子分泌，抑制T淋巴細胞活性，調節炎性反應[13]。
MSCs移植治療SCI的適宜時間，目前研究尚未統一。從病理機制上講，SCI后急性期由于血-脊髓屏障破壞，損傷區有嚴重的免疫炎性反應，多種炎性因子具有神經毒性及膠質細胞的誘發作用，使局部的微環境不適合MSCs的存活和分化。而SCI時間過長，損傷區膠質瘢痕的形成不利于軸突的生長。Okano等[14]提出SCI后干細胞移植的最佳時間應選擇在損傷后l～2周，在此期間進行移植，既可解除急性期各種炎性因子對移植細胞的損害，又可避免慢性期膠質瘢痕對軸突再生的干擾。本組患者均在慢性期行MSCs治療，有效患者與無效患者在損傷時間上無明顯差異。
本研究表明，UC-MSCs蛛網膜下腔注射治療SCI是安全的，可使大部分不完全性SCI患者神經功能在一定程度上得到恢復，但對完全性SCI患者無效，存在軟化灶的患者多數療效較差。UC-MSCs治療SCI的作用機制有待進一步研究，移植時機的選擇、取得顯著療效所需的MSCs的數量、療程數，以及最佳的治療途徑，需要大宗病例長期的隨機對照研究。
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